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综述：外泌体表面功能化用于靶向传递和体内成像跟踪
人阅读 发布时间：2022-05-25 17:45
1. 外泌体膜蛋白在修饰中的意义
蛋白质组学研究显示，在外泌体膜内存在以下蛋白质，①肌动蛋白、丝切蛋白和微管蛋白，它们是细胞骨架成分，②参与胞内膜融合的膜联蛋白和RAB蛋白，③热休克蛋白(HSP)，比如HSP70和HSP90，它们将错误折叠的蛋白质导向降解机制。主要组织相容性复合体MHCII类、MHCI类、CD86、整合素(αMβ2)、跨膜四蛋白、LA和Lamp2b则存在于外泌体膜上。其中MHCII类、MHCI类和CD86蛋白参与T细胞刺激，αMβ2，跨膜四蛋白， LA和Lamp-2b可用于靶向/粘附。跨膜四蛋白家族的不同成员(CD37、CD53、CD63、CD81和CD82)与其他蛋白如整合素和MHC蛋白相互作用，形成一个富含跨膜四蛋白的微域(TEM)。TEM不仅可以使细胞粘附、增殖和运动，还可以保持跨膜四蛋白的完整性和稳定性，并产生不同配体的结合位点。 LA由3个结构域组成：N端分泌信号肽结构域-协助LA进入外泌体、表皮生长因子(EGF)样结构域-有助于其被吞噬细胞识别、C端凝集素类型C1/C2 (C1C2)结构域-将其保留在外泌体表面。Lamp-2b在树突状细胞来源的外泌体中易被发现，在结肠癌和黑素瘤等部分癌细胞上表达，因此可以作为靶向部位特异性抗癌药物传递的靶点。
2. 外泌体表面修饰策略探索
2.1 基因工程
利用质 粒载体(编码与上述跨膜蛋白融合的配体)对产生外泌体的细胞进行基因工程是一种广泛应用的制备表面修饰外泌体(SME)的方法。多肽由于其体积小、结合亲和力高、对靶细胞/组织特异性强、免疫刺激活性低、毒性小等特点，是目前最广泛研究的靶向配体。然而，在外泌体形成过程中，细胞内泌体蛋白酶对肽的降解使肽功能化外泌体的产量具有挑战性。在基因水平上修饰外泌细胞是具有挑战性的。引入外泌体膜的靶向部分可能会影响外泌体膜蛋白的正常功能。此外，与用于非功能化或未修饰外泌体的技术相比，需要采用一种改进的纯化技术来分离SME。
2.2 共价修饰
点击化学是一种修饰外泌体表面的技术，一个炔基通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(EDC-NHS)缩合反应连接到分离的外泌体;然后在铜的存在下与叠氮基的靶向部分共价结合。点击化学反应高效，它们可以在有机溶剂和水性缓冲液中以较短的反应时间很好地进行。
外泌体亲本细胞的代谢工程是另一种基于点击化学的SME生产策略。它是通过在产生外泌体的细胞培养基中添加合成改性的氨基酸、脂类、聚糖或寡核苷酸来实现的，从而产生表面覆盖改性蛋白、脂类或聚糖的外泌体，在点击化学的帮助下，进一步用于融合任何靶向或标记部分。
2.3 非共价修饰
外泌体产生细胞的基因工程或点击化学是外泌体表面修饰的常用方法。与此同时，某些非共价修饰技术，如多价的静电相互作用、配体-受体相互作用、疏水作用/膜工程、基于核酸适配体的表面修饰和CP05肽锚定修饰，也在探索生产靶向外泌体。
多价的静电相互作用：特征是在外泌体膜上覆盖正电荷传递部分，从而提高外泌体对负电荷生物膜的靶向效率。
配体-受体相互作用：利用外泌体表面存在的天然受体来附着靶向配体。
疏水作用/膜工程：脂质体和外泌体之间的疏水相互作用是一种新方法，其中脂质体膜已经用肽、抗体或聚乙二醇(PEG)进行功能化，然后通过冻融方法融合外泌体和脂质体膜。产生的外泌体-脂质体杂交具有有效的靶向能力，且不影响外泌体膜蛋白的天然功能。
基于核酸适配体的表面修饰：基于核酸适配体的温和、选择性(针对外泌体)和简单的技术被开发用于外泌体表面修饰。在一项这样的研究中，最初LZH8适配体通过杂交链式反应(HCR)与另外两个核苷酸序列融合，形成纳米组装。这些附加的序列增强了适体与外泌体表面的结合亲和性。
CP05肽锚定修饰：CP05肽展示了一种简单的方法，在外泌体表面表达靶向或治疗部分。CP05肽对CD63的第二个EC环具有很强的亲和力，因此它是靶向/治疗部分与外泌体表面之间的良好连接。CP05锚修饰被证明可以保留外泌体的自然大小和形态特征，而不影响其在体内的分布。
3. 外泌体的成像/跟踪
SME已被有效地用于确定外泌体在体内的生物分布。体内外泌体的成像有助于确定：作为特定位点载体的适用性，在细胞间通信中的作用，半衰期。生物分布研究可以通过使用外源性或内源性标记的外泌体进行。
3.1 不同的外泌体标记技术
荧光标记: 在生物分布研究中，可以使用小分子的荧光团来标记外泌体，如亲脂性碳菁染料：PKH67， PKH26，DiI和DiR。优点：这是一种简单的外泌体标记方法，实时监测单细胞有助于研究外泌体与细胞相互作用。缺点：荧光强度低和组织穿透深度有限，很少用于跟踪细胞间运动；这些染料会影响生物分布的准确性。
生物发光标记：优点：通过自然的酶-底物反应产生生物荧光。缺点：在原代细胞中具有挑战性；用于产生化学发光的融合蛋白如gLuc-LA会随时间的推移迅速消失，这使到达每个器官的外泌体的数量难以估计。
放射性同位素标记：外泌体通过临床分级的放射性同位素如99mTc、131I、111In-oxine提供了一个更耐用和可靠的方法来研究外来体的体内生物分布。优点：在放射标记的外泌体经过降解后，它也可以提供定性和定量的估计，而且由于其组织渗透潜力，它还可以成像到更深的组织。缺点：技术存在严重的局限性，目前研究数量有限。
3.2 外泌体表面修饰在体内的应用
了解外泌体在靶点摄取的机制：通过使用染料标记外泌体，可以确定外泌体通过内吞途径内化到细胞中。研究显示，外泌体可以穿过血脑屏障（BBB），为中枢神经系统（CNS）靶向治疗神经退行性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病、中风或创伤开辟了新的通道。
了解外泌体的药代动力学和生物分布：生物发光已被用于了解外泌体的药代动力学和生物分布，以及外泌体/母细胞来源对这些参数的影响。Charoenviriyakul等人将PKH67标记的五种不同来源外泌体注入小鼠，证明所有类型的外泌体都被肝脏的巨噬细胞吸收。
了解免疫系统在目标部位外泌体摄取中的作用：巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分之一，它通过吞噬作用消除包括细菌、真菌、病毒甚至药物颗粒在内的任何外来颗粒。这些吞噬细胞的密度取决于所研究动物的免疫条件，从而影响外泌体的摄取。
4. SME用于靶向给药
SME已被广泛用于不同器官的靶向药物传递。关于SME方面的研究，大多数主要针对肿瘤以及不同器官的疾病。为便于讨论，分为靶向肿瘤组织和靶向其他组织的SME。
4.1 SME用于肿瘤靶向
肿瘤靶向载药可降低脱靶毒性，降低剂量，提高疗效。目前正在开发的用于评估载药SME疗效的肿瘤模型类型是原位或异位。下面根据靶器官对靶向SME的肿瘤进行分类讨论。
脑靶向SEM：Tang等人利用从Raw264.7细胞中分离的外泌体治疗胶质瘤。这些外泌体装载SPION和姜黄素，表面功能化肽RGE。RGE和FITC均通过涉及叠氮磺酰环加成反应的点击化学结合到外泌体表面。MRI分析结果中得出，RGE功能化的外泌体显示出有效的药物传递到胶质瘤细胞。
乳腺靶向SEM：从imDC中提取的外泌体通过基因工程形成iRGD-Lamp-2b阳性外泌体，通过电穿孔技术进一步装载DOX。体内抗肿瘤活性显示，在原位乳腺肿瘤小鼠体内IV给药iRGD-Exos-DOX后，显著控制肿瘤生长。
肺靶向SEM：肺靶向已尝试使用sigma受体配体氨基乙基酰胺(AA)修饰的外泌体治疗肺转移。
肝脏靶向SEM：DSPE-PEG功能化的HUVECs来源的外泌体被研究通过连接双配体、生物素和亲和素靶向肝脏。亲和素与凝集素有很强的结合亲和力，凝集素是一种在癌细胞上过表达的蛋白质。生物素促进的受体介导的内吞作用以及亲和素与凝集素的结合亲和性提高了细胞摄取，从而改善了外泌体的位点特异性作用。
结肠靶向SEM：结直肠癌CRC细胞过度表达A33抗原，A33抗体可作为结肠癌潜在的活性配体。CD47是结肠肿瘤细胞上的另一种过表达抗原，它与巨噬细胞和DC等免疫细胞上的信号调节蛋白-α (SIRP-α)相互作用，从而激活“不要吃我”信号。Koh等通过基因工程在外泌体表面产生SIRP-α变体，可破坏SIRP-α与CD47的相互作用，从而触发吞噬活性和肿瘤抑制。
4.2 SME靶向其他组织：
SME已被有效地用于肿瘤靶向。本节讨论外泌体使用肽(RVG， CTP，IMTP)和FA等配体靶向输送到肿瘤组织以外的其他组织。利用基因工程对含有与乙酰胆碱受体亲和的RVG肽的imDC来源的外泌体进行功能化，实现脑靶向。RVG肽附外泌体也被用来对抗马啡成瘾。
叶酸受体(FR)在多种癌症中过度表达，如肺癌、乳腺癌、脑癌、卵巢癌和宫颈癌，而在正常细胞和组织中很少表达。因此，FA可作为靶向配体用于靶向抗癌药物的传递。FA还通过内吞作用促进外泌体的内在化。
外部磁场也被用于外泌体的部位特异性输送。从携带Tf的血液RTC获得的血清来源的外泌体与Tf结合的SPMN孵育，通过Tf-Tf受体相互作用形成SMNC-Exos。在携带H22皮下肿瘤的昆明小鼠体内实验中，DOX-SMNC-Exos在磁场作用下的肿瘤体积明显小于未受磁场作用的DOX-SMNC-Exos。
肽装饰外泌体已经被探索使用CTP靶向心脏组织。研究发现CTP-Exo向心脏的体内传递比CTL-Exo多15%，而向脾脏和肝脏的传递没有显著差异，显示出CTPExo对心脏细胞的特异性。
总结：
本综述提供了通过表面修饰外泌体标记的靶向药物传递和新兴治疗应用的见解。了解外泌体在体内命运的意义在于确定合适的外泌体输送途径和了解外泌体在肿瘤微环境中的药理学行为。然而，在外泌体表面修饰过程中，还有一些需要关注的问题，例如SME的分离方法、稳定性、临床适用性等，如果这些问题都能得到妥善处理，那么SME肯定会发展成为一种有前途的药物运载工具。
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