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公司新闻/正文
外泌体促进乙酰化，看德国人是如何研究的？
1180 人阅读发布时间：2020-01-02 14:44
转移小生境的外泌体依赖性免疫监测需要p53的BAG6和CBP/p300依赖性乙酰化
2019年8月14日由德国马尔堡大学（肿瘤生物学与免疫学临床研究中心）、科隆大学医学院等单位合作在Theranostics（影响因子：8.537）发表的一篇题为《Exosome-dependent immune surveillance at the metastatic niche requires BAG6 and CBP/p300-dependent acetylation of p53》，报道了BAG6/CBP/p300-p53在EVs装载过程中的作用，进而影响其功能。
研究背景：
肿瘤细胞的EVs能促肿瘤微环境的形成及影响癌症的发展，如免疫逃逸和转移，EVs可促免疫细胞向远处器官的聚集。而黑色素瘤细胞的EVs不仅有促癌转移作用，亦有抑制癌症发展的作用，故作者想研究EVs是如何转载的，进而影响其功能。
技术路线：
实验结果：
1. 细胞应急条件下诱导细胞释放BAG6阳性EVs
HEK293和B-16V细胞在100nm阿霉素doxorubicin (doxo)和HDACi（LBH）作用16hours后，能显著提高细胞释放EVs的量。与此同时使用ELISA方法及检测出BAG6阳性EVs的量也比对照组要高。此外，低氧培养的B-16V细胞释放EVs量与对照组无差异，但BAG6阳性外泌体量明显高于对照组。
探究B-16V细胞释放的WT-EVs和BAG6KO-EVs功能差异？
NTA结果显示BAG6阳性EVs粒径小于对照组，对EVs标志蛋白的表达无影响，表明BAG6可能影响了EVs的亚群。
Figure 1. Cellular stress induces the release of BAG6-positive EVs.
2. WT-EVs和BAG6KO-EVs装载不同的mRNA和蛋白质
对WT-EVs和BAG6KO-EVs进行二代测序分析，与WT相比，有418个mRNA在BAG6KO-EVs中低/高表达。功能富集分析低表达的mRNA主要是参与线粒体相关代谢途径中的基因，而上调的mRNA主要是参与免疫反应、血管形成相关、细胞外基质、血小板激活（促黑色素瘤）等过程。如下图A所示，通过Q-PCR分析BAG6KO-EVs中高表达的促肿瘤基因的表达较WT-EVs高。
MS分析EVs中的蛋白质，如图B\C所示，有315个蛋白在两种EVs中低/高表达，33种蛋白在其中一种EVs中检测不到。在2种EVs中呈现相反表达的蛋白主要与囊泡特征distinct endosomal vesicle signatures相关， 如图C,与黑色素小体有关蛋白在WT-EVs中高表达在BAG6KO-EVs中低表达，但ESCRT组分在BAG6KO-EVs中高表达，同时，BAG6KO-EVs中高富集与迁移、血管形成相关蛋白，表明EVs中蛋白质富集不是随机的而是依赖于BAG6。
Figure 2. mRNA and protein cargo of BAG6-proficient and -deficient EVs define EV-subtypes.
3. BAG6-EVs具有抑制肺转移的作用
每周给予C57BL/6 20 μg的WT-EVs和BAG6KO-EVs或PBS,取肺进行测序分析，在WT-EVs处理过的肺中主要是参与免疫防御的基因高表达,如调控骨髓巨噬细胞发育的spic基因，对单核细胞和巨噬细胞趋化性弱 CD51\IL-10\CXCL13等。而BAG6KO-EVs处理过的肺中高表达参与激活中性粒细胞及其聚集过程，从而促瘤转移。
每天给予C57BL/6 10 μg的WT-EVs和BAG6KO-EVs或PBS，14天后给B-16V细胞成瘤。WT-EVs处理的肺中伴随着骨髓单核细胞的聚集,抑制肺转移。虽BAG6KO-EVs可诱导形成转移前微环境形成，但并未增加肿瘤转移。考虑可能是注射的B-16V释放的EVs对其干扰。
鉴于基质金属蛋白酶抑制剂TIMP3在WT-EVs中富集，同时数据库也表明TIMP3高表达与良好生存率相关，WT-EVs诱导的骨髓单核细胞向M1巨噬细胞分化，而这种现象通过与BAG6KO-EVs孵育而消失，并通过TIMP3的过度表达而被挽救。表明BAG6依赖性的招募TIMP3参与了WT-EVs的抗转移作用。
Figure 3. BAG6-presenting but not BAG6-deficient EVs inhibit metastasis to the lung.
4. P53蛋白是BAG6-EVs外泌体释放所需的
Figure1表明HDACi处理可诱导BAG6-positive EVs释放，鉴于BAG6是CBP/p300乙酰转移酶（可乙酰化p53）重要的辅酶，因此BAG6/CBP/p300-p53 complex是否参与BAG6-positive EVs的释放？
通过IP实验证明Doxo处理后，p53和 BAG6/CBP/p300复合物结合在一起，图B：在无细胞体系中获得的体外翻译蛋白的相互作用证实了p53和BAG6的结合。如图C，Doxo或LBH处理P53KO的HCT116细胞，不能诱导高EVs的释放，但再转入p53WT而非乙酰化位点突变的p53能逆转上述现象。E图显示BAG6阳性EVs在TCL-1转基因小鼠（模拟慢性淋巴细胞白血病(CLL)）p53KO脾中少，表明p53影响EVs的释放。
Figure 4. p53 is critically involved in the inducible release of BAG6-presenting EVs.
5. BAG6 和CBP/p300 诱导 p53乙酰化并调控EVs的释放
那么BAG6/CBP/p300是否乙酰化P53及作用于EVs释放？
建立BAG6KO and CBP/p300 double KO (dKO) HEK293 和B-16V细胞，发现p53的乙酰化（Lysine 373）几乎完全消失，表明BAG6是p53（Lysine 373）乙酰化所需。同时如图B，在BAG6KO细胞中表达WT-BAG6可恢复p53乙酰化。与此同时发现在无应急作用下BAG6KO具有促进细胞释放EVs的作用， 如图C nuc-BAG6突变体（存在于细胞核中，不能进入胞质）的过表达在一定程度上可抑制BAG6KO引起的EVs分泌增加,而WT-BAG6的过表达不能抑制EVs释放（C图）。
因此nus-BAG6是否将CBP/p300招募在核中，从而抑制EVs的释放？
WB分析细胞质中的CBP/p300量，Doxo的作用促进CBP/p300在胞质中富集，而BAG6KO则抑制其进入胞质。
故，在无刺激下，BAG6主要位于细胞核中，抑制EVs的释放。DOXO可诱导核输出BAG6,与CBP/p300一起诱导p53的乙酰化，进而促进BAG6阳性EVs的释放。
Figure 5. BAG6 and CBP/p300 are crucial for the acetylation of p53 and regulate the release of EVs.
Figure 6. Doxo treatment induces complex formation between BAG6 and ESCRT proteins.
7. 人类黑色素瘤中BAG6阳性EVs形成的相关性
TCGA分析在肿瘤患者体内BAG6与肿瘤的进展呈现相反趋势，III/IV期要低于早期。同时致癌蛋白CTNNAL1（诱导恶性转移）在转移性患者血浆EVs中高表达。BAG6 786位密码子突变为终止子后，过表达突变体不能在BGA6KO的细胞中促进p53乙酰化，但在WT细胞中可抑制p53乙酰化，表明突变体是WT-BAG6的负调控因子。
Figure 7. Relevance of BAG6-dependent EV formation in human melanoma.
2019年8月14日由德国马尔堡大学（肿瘤生物学与免疫学临床研究中心）、科隆大学医学院等单位合作在Theranostics（影响因子：8.537）发表的一篇题为《Exosome-dependent immune surveillance at the metastatic niche requires BAG6 and CBP/p300-dependent acetylation of p53》，报道了BAG6/CBP/p300-p53在EVs装载过程中的作用，进而影响其功能。
研究背景：
肿瘤细胞的EVs能促肿瘤微环境的形成及影响癌症的发展，如免疫逃逸和转移，EVs可促免疫细胞向远处器官的聚集。而黑色素瘤细胞的EVs不仅有促癌转移作用，亦有抑制癌症发展的作用，故作者想研究EVs是如何转载的，进而影响其功能。
技术路线：
实验结果：
1. 细胞应急条件下诱导细胞释放BAG6阳性EVs
HEK293和B-16V细胞在100nm阿霉素doxorubicin (doxo)和HDACi（LBH）作用16hours后，能显著提高细胞释放EVs的量。与此同时使用ELISA方法及检测出BAG6阳性EVs的量也比对照组要高。此外，低氧培养的B-16V细胞释放EVs量与对照组无差异，但BAG6阳性外泌体量明显高于对照组。
探究B-16V细胞释放的WT-EVs和BAG6KO-EVs功能差异？
NTA结果显示BAG6阳性EVs粒径小于对照组，对EVs标志蛋白的表达无影响，表明BAG6可能影响了EVs的亚群。
Figure 1. Cellular stress induces the release of BAG6-positive EVs.
2. WT-EVs和BAG6KO-EVs装载不同的mRNA和蛋白质
对WT-EVs和BAG6KO-EVs进行二代测序分析，与WT相比，有418个mRNA在BAG6KO-EVs中低/高表达。功能富集分析低表达的mRNA主要是参与线粒体相关代谢途径中的基因，而上调的mRNA主要是参与免疫反应、血管形成相关、细胞外基质、血小板激活（促黑色素瘤）等过程。如下图A所示，通过Q-PCR分析BAG6KO-EVs中高表达的促肿瘤基因的表达较WT-EVs高。
MS分析EVs中的蛋白质，如图B\C所示，有315个蛋白在两种EVs中低/高表达，33种蛋白在其中一种EVs中检测不到。在2种EVs中呈现相反表达的蛋白主要与囊泡特征distinct endosomal vesicle signatures相关， 如图C,与黑色素小体有关蛋白在WT-EVs中高表达在BAG6KO-EVs中低表达，但ESCRT组分在BAG6KO-EVs中高表达，同时，BAG6KO-EVs中高富集与迁移、血管形成相关蛋白，表明EVs中蛋白质富集不是随机的而是依赖于BAG6。
Figure 2. mRNA and protein cargo of BAG6-proficient and -deficient EVs define EV-subtypes.
3. BAG6-EVs具有抑制肺转移的作用
每周给予C57BL/6 20 μg的WT-EVs和BAG6KO-EVs或PBS,取肺进行测序分析，在WT-EVs处理过的肺中主要是参与免疫防御的基因高表达,如调控骨髓巨噬细胞发育的spic基因，对单核细胞和巨噬细胞趋化性弱 CD51\IL-10\CXCL13等。而BAG6KO-EVs处理过的肺中高表达参与激活中性粒细胞及其聚集过程，从而促瘤转移。
每天给予C57BL/6 10 μg的WT-EVs和BAG6KO-EVs或PBS，14天后给B-16V细胞成瘤。WT-EVs处理的肺中伴随着骨髓单核细胞的聚集,抑制肺转移。虽BAG6KO-EVs可诱导形成转移前微环境形成，但并未增加肿瘤转移。考虑可能是注射的B-16V释放的EVs对其干扰。
鉴于基质金属蛋白酶抑制剂TIMP3在WT-EVs中富集，同时数据库也表明TIMP3高表达与良好生存率相关，WT-EVs诱导的骨髓单核细胞向M1巨噬细胞分化，而这种现象通过与BAG6KO-EVs孵育而消失，并通过TIMP3的过度表达而被挽救。表明BAG6依赖性的招募TIMP3参与了WT-EVs的抗转移作用。
Figure 3. BAG6-presenting but not BAG6-deficient EVs inhibit metastasis to the lung.
4. P53蛋白是BAG6-EVs外泌体释放所需的
Figure1表明HDACi处理可诱导BAG6-positive EVs释放，鉴于BAG6是CBP/p300乙酰转移酶（可乙酰化p53）重要的辅酶，因此BAG6/CBP/p300-p53 complex是否参与BAG6-positive EVs的释放？
通过IP实验证明Doxo处理后，p53和 BAG6/CBP/p300复合物结合在一起，图B：在无细胞体系中获得的体外翻译蛋白的相互作用证实了p53和BAG6的结合。如图C，Doxo或LBH处理P53KO的HCT116细胞，不能诱导高EVs的释放，但再转入p53WT而非乙酰化位点突变的p53能逆转上述现象。E图显示BAG6阳性EVs在TCL-1转基因小鼠（模拟慢性淋巴细胞白血病(CLL)）p53KO脾中少，表明p53影响EVs的释放。
Figure 4. p53 is critically involved in the inducible release of BAG6-presenting EVs.
5. BAG6 和CBP/p300 诱导 p53乙酰化并调控EVs的释放
那么BAG6/CBP/p300是否乙酰化P53及作用于EVs释放？
建立BAG6KO and CBP/p300 double KO (dKO) HEK293 和B-16V细胞，发现p53的乙酰化（Lysine 373）几乎完全消失，表明BAG6是p53（Lysine 373）乙酰化所需。同时如图B，在BAG6KO细胞中表达WT-BAG6可恢复p53乙酰化。与此同时发现在无应急作用下BAG6KO具有促进细胞释放EVs的作用， 如图C nuc-BAG6突变体（存在于细胞核中，不能进入胞质）的过表达在一定程度上可抑制BAG6KO引起的EVs分泌增加,而WT-BAG6的过表达不能抑制EVs释放（C图）。
因此nus-BAG6是否将CBP/p300招募在核中，从而抑制EVs的释放？
WB分析细胞质中的CBP/p300量，Doxo的作用促进CBP/p300在胞质中富集，而BAG6KO则抑制其进入胞质。
故，在无刺激下，BAG6主要位于细胞核中，抑制EVs的释放。DOXO可诱导核输出BAG6,与CBP/p300一起诱导p53的乙酰化，进而促进BAG6阳性EVs的释放。
Figure 5. BAG6 and CBP/p300 are crucial for the acetylation of p53 and regulate the release of EVs.
6. Doxo的刺激能促进BAG6与ESCRT形成复合物
COIP实验发现BAG6 与ESCRT-proteins HRS, TSG101 and Alix结合在一起；同时序列分析BAG6具有可募集TSG101的晚期核内基序P(S/T)AP，酵母双杂交实验证明了BAG6是与 TSG101结合的。
Figure 6. Doxo treatment induces complex formation between BAG6 and ESCRT proteins.
7. 人类黑色素瘤中BAG6阳性EVs形成的相关性
TCGA分析在肿瘤患者体内BAG6与肿瘤的进展呈现相反趋势，III/IV期要低于早期。同时致癌蛋白CTNNAL1（诱导恶性转移）在转移性患者血浆EVs中高表达。BAG6 786位密码子突变为终止子后，过表达突变体不能在BGA6KO的细胞中促进p53乙酰化，但在WT细胞中可抑制p53乙酰化，表明突变体是WT-BAG6的负调控因子。
Figure 7. Relevance of BAG6-dependent EV formation in human melanoma.