外泌体携带的lncRNA ZFAS1通过microRNA-124/STAT3调节食管鳞状细胞癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡

研究背景：
       食道癌是全球第六大癌症死亡原因，也是第八大最常见的癌症类型，全世界每年报告近33万新病例，每年死于食道癌的人数超过270,000特别是食管癌在中国很普遍，食道癌的主要亚型是食道鳞状细胞癌（ESCC）。人们认为药物可有效治疗ESCC，包括铂，紫杉烷，伊立替康，氟嘧啶和靶向治疗。食管癌的主要危险因素是饮酒和吸烟，但其他引起食道粘膜慢性刺激的疾病也可能增加食管癌的危险。ESCC的诊断和治疗有显着改善，但是接受治疗的患者的5年生存率仅为25–30％。因此，迫切需要探索用于治疗ESCC的准确的治疗靶标。
       长链非编码RNA（lncRNA）是一类非编码RNA，lncRNA通过不同的机制在发育，分化和肿瘤形成中发挥作用。LncRNA ZFAS1是新发现的在人乳腺癌中被下调的lncRNA，它可能是一种癌症抑制因子。先前的研究表明，lncRNA ZFAS1表达在ESCC组织中高表达，而ZFAS1在ESCC组织中的高表达表明患者的存活率较差。外泌体通过传输活性分子介导癌症中的细胞通讯。一项研究表明，外泌体介导的lncRNA ZFAS1促进胃癌的进展。微小RNA（miRNA）可以调节基因表达，是小的非编码RNA分子。miR-124是大脑中最丰富的miRNA。有趣的是，先前的研究表明，中国哈萨克族人口中的miR-124多态性可能会改变ESCC的风险。miR-124的直接靶标之一是信号转导子和转录激活子3（STAT3）。STAT3是胞质转录因子家族的成员之一，它是92kDa大的转录因子，其基因在染色体17q21。有研究表明，miR-143可能通过下调STAT3来抑制ESCC的增殖，侵袭和转移。本实验的主要目的是研究外泌体的ZFAS1对ESCC细胞的生长活性，侵袭和迁移的影响及其分子机制。
技术路线：

研究结果：
1. 在ESCC组织中LncRNA ZFAS1上调而miR-124下调
       最初，在136例ESCC组织及其相应的邻近正常组织中检测到ZFAS1和miR-124的表达。RT-qPCR结果显示，ESCC组织中ZFAS1表达较高，而miR-124表达较低。食管鳞癌组织中ZFAS1表达与miR-124表达的相关性分析结果表明，食管鳞癌组织中ZFAS1表达与miR-124表达呈负相关（r = − 0.749，p<0.001）。然后将ESCC患者分为高表达组（n = 69）和低表达组（n = 67）根据ESCC组织中ZFAS1表达的中值进一步分析ZFAS1表达与ESCC患者的临床病理特征之间的关系，发现ZFAS1的表达与患者无关性别和年龄，并与肿瘤大小，肿瘤结节转移阶段以及是否存在LNM有关，这意味着在TNM III + IV期且存在LNM的情况下，肿瘤大小大于3 cm的患者ZFAS1过表达率较高。同时，通过RT-qPCR检测ZFAS1在人正常食管上皮细胞HEEC和5种ESCC细胞系EC9706，Eca109，TE13，TE1和TTN中的表达。结果表明与HEEC细胞相比，ZFAS1在五种ESCC细胞中的表达均有不同程度的增加（均p <0.05）。ZFAS1在Eca109细胞株中的表达明显高于EC9706，TE-13，TE-1和TTN细胞株，因此选择Eca109细胞株进行后续实验。


图1：ZFAS1在ESCC中高表达而miR-124在低表达。a：通过RT-qPCR检测ESCC组织及其邻近正常组织中ZFAS1表达（n = 136）。b：通过RT-qPCR检测ESCC组织及其附近正常组织中miR-124的表达（n = 136）。c：通过皮尔森相关分析分析ESCC组织中ZFAS1和miR-124表达之间的相关性。d：RT-qPCR检测到人正常食管上皮细胞HEEC和5种ESCC细胞系中ZFAS1的表达。

2. 食管鳞癌患者ZFAS1表达与临床病理特征的关系


3. 沉默ZFAS1抑制细胞增殖，迁移和侵袭并促进ESCC细胞凋亡
       为了观察ZFAS1是否影响ESCC的发育，我们使用RT-qPCR检测转染后Eca109细胞中ZFAS1的表达。分析显示（图2a），与sh-NC组相比，sh-ZFAS1-1组，sh-ZFAS1-2组和sh-ZFAS1-3组的ZFAS1表达下降，并且sh-ZFAS1-1组中ZFAS1表达最低（所有p<0.05）。因此，在以下实验中，选择了sh-ZFAS1-1组中的序列以沉默ZFAS1，并将其命名为sh-ZFAS1。RT-qPCR的还用于检测在食管癌Eca109细胞的miR-124表达转染的SH-ZFAS1后，结果表明，（图2b）与sh-NC组有关，在sh-ZFAS1组中miR-124表达升高。EdU测定的结果，集落形成试验，划痕试验和Transwell小室法，显示出降低的增殖，集落形成，sh-ZFA S1处理的细胞中的迁移，迁移和侵袭（所有p<0.05）。此外，流式细胞术结果与SH-ZFAS1（处理的细胞显示促进细胞凋亡p<0.05）（图2e）。裸鼠肿瘤异种移植测试了sh-ZFAS1对体内肿瘤生长的影响，结果显示，与sh-NC组相比，sh-ZFAS1组的肿瘤生长能力下降了（p<0.05））。这些发现表明ZFAS1的沉默可以抑制ESCC细胞的增殖，集落形成，侵袭，迁移和体内肿瘤生长，但是促进细胞凋亡。


图2：干扰ZFAS1的表达可抑制ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并促进其凋亡。a：通过RT-qPCR确定ZFAS1在Eca109细胞中的干扰效率。b：RT-qPCR检测到Eca109细胞中miR-124表达。c：使用EdU测定法的Eca109细胞的增殖。d：使用菌落形成试验的菌落形成能力。e：使用流式细胞术检测各组中Eca109细胞的凋亡。f：使用划痕测试，各组中的Eca109细胞迁移。g：使用Transwell测定法对每组中的Eca109细胞的侵袭。h：各组肿瘤体积增长曲线，n ＝ 5。sh-NC组：用sh-ZFAS1质粒NC转染的Eca109细胞，sh-ZFAS1组：用sh-ZFAS1质粒转染的Eca109细胞。

4. ESCC细胞通过外泌体将ZFAS1传递至周围的癌细胞
       我们进一步研究了ESCC细胞对周围细胞的作用机理。通过差速离心从ESCC细胞系Eca109的培养基中分离出白色沉淀物。在透射电镜下，白色沉淀物是具有双层膜结构的微囊，呈圆形或椭圆形，囊泡的直径约为30-60 nm，这与外泌体的形态特征相符。Western印迹分析发现，该白色沉淀具有外泌体标记物（CD63，CD9，CD81）。因此，我们确认这些白色沉淀物是外泌体。通过激光共聚焦显微镜观察到的结果表明，外泌体是摄取食管癌Eca109受体细胞和周围的核。因此，ESCC细胞通过外泌体将ZFAS1传递至周围的癌细胞，从而影响ESCC的发育。同时，用Oe-ZFAS1质粒和sh-ZFAS1质粒转染后，利用RT-qPCR检测ZFAS1在供体Eca109细胞，外泌体和受体Eca109细胞中的表达。结果表明转染Oe-ZFAS1质粒后，相对于相应的NC细胞，ZFaS1表达在Eca109供体细胞，外泌体和受体细胞中升高（所有p<0.05），但在用shRNA ZFAS1质粒转染后在Eca109供体细胞，外泌体和受体细胞中下降（全部p＜0.05）。



图3：ESCC细胞通过外泌体将ZFAS1传递至周围的癌细胞。a：通过TEM观察到圆形或椭圆形膜状囊泡的外泌体的形态特征。b：通过蛋白质印迹分析检测到的外泌体表面标记蛋白CD63，CD9和CD81。c：激光共聚焦观察荧光标记的外泌体和外泌体摄取（×400），通过RT-qPCR检测ZFAS1在受体细胞中的表达。d：通过RT-qPCR确定ZFAS1在供体Eca109细胞，外泌体和受体Eca109细胞中的表达。

5. LncRNA ZFAS1作为竞争性内源RNA（ceRNA）调节miR-124






























图4：LncRNA ZFAS1调节miR-124。a：进行FISH测定以验证ZFAS1亚细胞定位。b：在RNA22网站中预测ZFAS1和miR-124之间的结合位点。c：进行双重荧光素酶报告基因检测ZFAS1和miR-124的组合。d：通过RIP测定法检测到的ZFAS1和Ago2的组合。e：通过RNA下拉测定法检测到的miR-124对ZFAS1的富集。f：通过RT-qPCR检测到的每组中miR-124的表达。g：在RNA22网站中预测miR-124和STAT3之间的结合位点。H：通过双重荧光素酶报告基因测定法检测到的miR-124和STAT3的组合。i：通过RT-qPCR检测的各组中的STAT3表达。

6. 外泌体携带ZFAS1促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并通过下调miR-124和上调STAT3的表达来抑制细胞凋亡
       通过建立共培养模型研究了外泌体ZFAS1穿梭入受体细胞的情况和作用。将供体细胞和受体细胞与Cy3标记的Oe-ZFAS1质粒，sh-ZFAS1质粒或miR-124抑制剂共培养24小时后，检测外泌体ZFAS1对ESCC细胞增殖，凋亡，迁移和侵袭的影响。结果表明，与Oe-NC-exo组相比，Oe-ZFAS1-exo组ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭增加，而细胞凋亡却减少。与sh-NC-exo组有关，sh-ZFAS1-exo组的细胞增殖，迁移和侵袭减少，凋亡增加（所有p <0.05）。RT-qPCR检测Oe-ZFAS1-exo和sh-ZFAS1-exo处理后外泌体和受体细胞中miR-124和STAT3的表达，证明miR-124在ET-ZFAS1-exo和sh-ZFAS1-exo中被下调。 ZFAS1过表达并与受体细胞共培养的供体细胞后，外泌体和受体细胞的趋势在sh-ZFAS1-exo组和Oe-ZFAS1-exo组中是合适的。与抑制剂NC-exo组相比，miR-124抑制剂-exo组的细胞增殖，迁移和侵袭能力增加，而细胞凋亡减少（所有p<0.05）。RT-qPCR检测到外泌体和受体细胞中miR-124抑制后miR-124和STAT3的表达。结果表明，具有miR-124抑制作用的供体细胞与受体细胞共培养，并且在外泌体和受体细胞中miR-124下调而STAT3上调。获得的数据证明外泌体ZFAS1可能上调STAT3而下调miR-124，从而促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，抑制其凋亡，进而导致ESCC肿瘤的发生和发展。


图5：外泌体携带ZFAS1下调miR-124，上调STAT3，以促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并抑制细胞凋亡。a：使用EdU测定法的细胞增殖。b：通过流式细胞术检测各组中的细胞凋亡。c：使用划痕测试进行细胞迁移。d：使用Transwell测定法侵袭细胞。Ë：ZFAS1-exo过表达或miR-124-exo低表达后，miR-124和STAT3在外泌体和受体细胞中的表达。Oe-NC-exo组：将经Cy3标记的Oe-ZFAS1质粒NC转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养；Oe-ZFAS1-exo组：将经Cy3标记的Oe-ZFAS1质粒转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养。sh-NC-exo组：将经Cy3标记的sh-ZFAS1质粒NC转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养。sh-ZFAS1-exo组：将经Cy3标记的sh-ZFAS1质粒转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养。抑制剂NC-exo组：将经Cy3标记的miR-124抑制剂NC转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养。miR-124抑制剂-exo组：将用Cy3标记的miR-124抑制剂转染的供体Eca109细胞与受体Eca109细胞共培养。

7. ZFAS1表达升高可促进裸鼠的肿瘤生长
       如图所示，与OE-NC-exo相比，OE-ZFAS1-exo中的肿瘤生长的能力显著从第3周（增加的P<0.05）。RT-qPCR显示，Oe-ZFAS1-exo组中miR-124的表达显着降低，而STAT3的表达相对于Oe-NC-exo组上调（均为p<0.05）。免疫印迹分析的结果表明，STAT3的OE-ZFAS1-exo中的表达明显高于OE-NC-exo。综上所述，ZFAS1-exo的过表达可以促进裸鼠在体内的生长。



图6：ZFAS1-exo的过表达可促进裸鼠肿瘤在体内的生长。a：各组的肿瘤体积生长曲线。b：通过RT-qPCR检测miR-124和STAT3表达。c：采用蛋白质印迹分析以验证STAT3蛋白表达。

讨论区：
       ESCC由多种遗传因素引起，包括miRNA失调和单核苷酸多态性（SNP），以及吸烟，叶酸缺乏，喝热茶和饮酒等环境风险。有研究报道在ESCC组织中lncRNA ZFAS1表达升高。另外，一项研究为中国哈萨克族人群的ESCC风险与miR-124多态性之间的相关性提供了新的见解，而miR-124多态性可能会改变患ESCC风险等。提示STAT3可能上调ESCC中的MMP2以促进肿瘤转移。尽管手术，放疗和化学疗法的结合可以使疾病得到了改善，但结果令人失望，尤其是转移性ESCC。由于尚需挖掘ZFAS1在食管鳞癌中的相关机制，本研究的目的是探讨外泌体ZFAS1对食管鳞癌的发展及其分子机制的影响，从而为进一步研究食管鳞癌的发病机理提供新的思路。总体而言，我们的研究表明，外泌体ZFAS1可能上调STAT3以促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并通过下调miR-124抑制其凋亡，从而引起ESCC肿瘤发生的发展。
       根据我们的发现，ESCC中的lncRNA ZFAS1被上调，而miR-124的表达被下调。与我们的研究一致，lncRNA ZFAS1与神经胶质瘤的预后不良和上调有关。在一项研究中，它表明ZFAS1在肝细胞癌中经常升高，这与我们的结果一致。此外，从我们的研究中发现，沉默ZFAS1可以抑制增殖，迁移和侵袭并促进ESCC细胞凋亡。一项研究表明，抑制lncRNA ZFAS1可以抑制神经胶质瘤细胞的体外增殖，迁移和侵袭。另一项研究证实，ZFAS1沉默可抑制增殖和细胞周期，侵袭，迁移和上皮-间质转化的过程。一项研究表明，miR-124-3p在ESCC组织中表达较低。另一项研究还表明，miR-124表达在ESCC组织中降低，并且与临床病理参数有关，如预后不良。
       此外，我们发现ESCC细胞通过外泌体将ZFAS1传递至周围的癌细胞，升高的ZFAS1-exo促进了裸鼠的肿瘤生长。外泌体储存在多囊泡体（MVB）中，由内体产生。通过与细胞膜融合，被释放到内环境中。它被封闭在含有核酸和蛋白质的双分子层状脂质膜中。在血液中循环中被所有细胞分泌，被周围的或远端的细胞选择性吸收，并可以根据它们的活性货物含量重新编程为受体细胞。先前的研究表明，通过ZFAS1的转移，外泌体可促进胃癌细胞的增殖和迁移。除此之外，我们的研究表明ZFAS1可以通过抑制miR-124的表达来促进STAT3的表达。一项研究中的数据表明ZFAS1在物理上与miR-150结合，并可能充当ceRNA。此外，lncRNA MALAT1在非小细胞肺癌细胞中高表达，而miR-124表达不佳，而miR-124是MALAT1的直接靶标。有人提出，高水平的ZEB1-AS1可能与STAT3激活呈正相关。有趣的是，先前的研究表明STAT3可以调用lncRNA PVT1转录并形成反馈调节环，而lncRNA PVT1通过与STAT3蛋白相互作用来激活STAT3信号通路。这些证据支持外泌体携带ZFAS1促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭，并通过下调miR-124和上调STAT3抑制细胞凋亡。
结论：
      总之，我们的研究结果表明，外泌体中的ZFAS1可能通过下调miR-124来上调STAT3，从而促进ESCC细胞的增殖，迁移和侵袭并抑制其凋亡，从而导致ESCC发生肿瘤。本文为进一步研究ESCC的发病机理提供了新思路。但是，我们尚未分析ESCC患者的生存信息，这将在以后的研究中得到验证。