肝星状细胞来源的外泌体缺失miR-148a-3p通过 ITGA5/PI3K/Akt轴促进肝癌的进展，10分+，高分文章轻松拿捏！

目前，肝细胞癌（HCC)是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一，虽然肝星状细胞(HSCs)在肝癌的发生发展中起着重要作用，但其与肿瘤细胞相互作用的分子机制尚不清楚。作者通过miRNA阵列分析筛选出肝癌细胞共培养的HSCs （LX-2细胞）中异常低表达的miR-148a-3p；HSCs中过表达miR-148a-3p可明显抑制共培养的HCC细胞体外和体内增殖；从外泌体的方向分析发现miR-148a-3p过表达的HSCs分泌的外泌体可在体内体外抑制肝癌的进展；在肝癌细胞中，miR-148a-3p通过靶向ITGA5进一步抑制PI3K/Akt信号的活性，从而介导肝癌进展抑制作用。

   发表杂志：《International journal of biological sciences》

   文章标题：《Exosome-depleted MiR-148a-3p derived from Hepatic Stellate Cells Promotes Tumor Progression via ITGA5/PI3K/Akt Axis in Hepatocellular Carcinoma》

 

 

一、与肝癌细胞共培养的肝星状细胞（HSCs）的miRNA表达谱

 

 

   A：作者将人HSC细胞株LX-2分别与三种肝癌细胞株PLC/PRF/5（PLC）、SMMC-7721（7721）和 HCCLM3（LM3）共培养两周，来研究HSC与肿瘤细胞在微环境中的相互作用。

   B-D:利用miRNA阵列分析鉴定共培养LX-2细胞的表达谱。从阵列中存在的2549个miRNAs探针中发现，在PLC/PRF/5, SMMC-7721或HCCLM3 LX-2共培养的细胞中分别检测到51、34或61个异常miRNAs。

   E:有28个miRNAs是3种共培养细胞中都表达异常的。

   F:进一步KEGG富集分析发现miR-148a-3p显著参与癌症相关通路。

   根据以上结果，miR-148a-3p被用于后续实验的研究。

 

二、miR-148a-3p在HSCs和原发性肝癌相关成纤维细胞中低表达以及HSC中过表达miR-148a-3p抑制共培养的HCC细胞体外和体内增殖

 

   A：LX-2细胞分别与PLC/PRF/5, SMMC-7721或HCCLM3共培养，然后检测共培养LX-2细胞中miR-148a-3p的表达。结果显示，与对照组相比，共培养的LX-2细胞中miR-148a-3p的表达均显著降低。

   B：作者收集HCC肿瘤组织，通过磁珠分选出CAFs，检测miR-148a-3p的表达情况。通过对CAFs的形态学观察并结合WB和IHC检测，鉴定CAFs。作在检测到的17个成对组织样本中，与正常成纤维细胞比较，CAFs中的miR-148a的表达水平均显著下调。

   C：过表达miR-148a-3p的LX-2细胞与HCC细胞共培养。结果显示，与过表达miR-148a-3p的LX-2细胞共培养，HCC细胞的细胞活力显著受到抑制。

   D：LM3和LX-2 OE-miR-148a 或control （LX-2 NC）通过皮下注射入Balb/c无胸腺雄性小鼠中，研究HSCs对HCC的体内作用。4周后，结果显示，注射LX-2 OE-miR-148a相比于对照组，肿瘤组织更小。

   E-F:miR-148a-3p在与共培养的LX-2细胞的外泌体中低表达，同时HCC患者来源的原发性CAFs分泌的外泌体中的表达也呈低水平状态。

 

 

 

三、miR-148a-3p过表达 HSCs来源的外泌体在体外和体内可抑制肝癌的致瘤功能

 

 

   A：利用共聚焦显微镜观察发现，过表达miR-148a-3pLX-2细胞的外泌体可被HCC细胞顺利摄取。

   B：与对照组相比，在miR-148a-3p过表达的外泌体共培养的HCC细胞表现出更高的miR-148a-3p水平。

   C：研究外泌体miR-148a-3p被HCC细胞摄取后是否具有抑癌作用，作者通过测定其增殖和侵袭能力进行评估。结果显示，miR-148a-3p 过表达的外泌体显著抑制肿瘤细胞的增殖能力、细胞活力和侵袭能力。

   F：从转染Cy5标记的hsa-miR-148a-3p agomir或agomir NC 的LX-2细胞培养基中分离得到外泌体，随后，外泌体通过尾静脉注入原位肝肿瘤BALB/c小鼠中，连续注射4周，每周3次。通过扫描激光共聚焦显微镜对肿瘤冷冻切片进行评估，检测到agomir的Cy5信号，表明肿瘤细胞摄取了外泌体。

   G：过表达miR-148a-3p外泌体可显著抑制肝癌细胞增殖。

 

 

 

四、miR-148a-3p作为肿瘤抑制因子，通过靶向ITGA5影响PI3K/Akt信号通路，抑制肝癌细胞的恶性特征

 

 

   A-C：为了评估miR-148a-3p在HCC细胞中的功能，作者将过表达的miR-148a慢病毒或对照分别转染到PLC、7721和LM3中。通过实验发现，过表达miR-148a可显著抑制HCC细胞增殖、侵袭和迁移。

   D：为了进一步寻找miR-148a-3p抑制HCC进展的潜在机制，作者在5个miRNA靶基因预测数据库中（miRDB, miRTargetBase, miRanda, TargetScan, picTar）寻找miR-148a-3p的候选靶基因。

   E：作者通过qRT-PCR分析验证靶基因的表达，发现ITGA5与miR-148a-3p的表达变化相反。

   F：在293T细胞中进行双荧光素酶报告基因检测，结果表明，与ITGA5-3'UTR-WT相比，miR-148a-3p的过表达显著降低了ITGA5-3'UTR-WT的萤火虫荧光素酶活性。

   G：作者评估HCC细胞中过表达miR-148a-3p后PI3K和Akt的水平及其磷酸化状态，结果显示ITGA5、磷酸化PI3K (P-PI3K)和磷酸化Akt (P-Akt)表达显著降低，而E-cad水平水平显著增高。

   这些结果表明，miR-148a-3p/ITGA5轴通过EMT调控PI3K/Akt信号的活性，介导HCC细胞的恶性特征。

 

 

 

五、miR-148a-3p和ITGA5与HCC患者预后相关

 

 

   A-B:为了探讨miR-148a-3p在HCC患者中表达的临床意义，作者通过TCGA-LIHC数据集发现，与正常组织相比，miR-148a-3p在肝癌组织中表达下调，而且GSE 36915数据集验证了这一结果。

   C：根据miR-148a-3p在肿瘤组织中的中位表达量将患者分为高表达亚组和低表达亚组。结果表明，miR-148a-3p低表达患者的OS时间明显短于高表达组。

   D：随后对146例HCC患者血浆样本进行生信分析。结合TCGA数据，血浆中miR-148a-3p低表达患者的OS时间明显较短。

   E-F：利用TCGA数据库检测HCC患者的ITGA5，发现ITGA5在肿瘤组织中明显上调，这与HCC患者的OS较差有关。