【J Nanobiotechnology】10+，循环肿瘤细胞来源的外泌体传递的LRNA TTN-AS1可以促进胆管癌细胞的增殖和迁移

        胆管癌(CCA)是胆管最常见和侵袭性的恶性肿瘤。其异质性高，恶性程度高，信号通路复杂，预后差，易发生转移。由于早期症状不明显，缺乏特异性的分子标志物，以及合适的早期诊断方法，大多数CCA患者诊断为晚期，导致5年生存率低于10%。因此，迫切需要新的生物标志物和治疗靶点来提高早期发现和患者预后。

湾湾今天分享的是一篇发表在【J Nanobiotechnology】（IF：10.6）上题为“Circulating tumor cell-derived exosome– transmitted long non-coding RNA TTN-AS1 can promote the proliferation and migration of cholangiocarcinoma cells”的研究，该研究建立了胆管癌CTC类器官模型，并首次对胆管癌瘤CTC类器官分泌的外泌体进行了转录组测序。结果证实，来自CCA CTCs的外泌体可以转运TTN-AS1，促进CCA细胞的生长和转移。该研究也证实了LncRNA TTN-AS1在胆管癌瘤组织中的高表达，并发现TTN-AS1表达与淋巴结转移和TNM分期有显著相关性。此外，该研究还发现 LncRNA TTN-AS1在胆管癌患者的血液和血清外泌体中表达升高，两者与TNM分期和淋巴结转移有关。血清外泌体中的TTN-AS1有望成为胆管癌诊断和治疗的潜在生物标志物。通过外泌体传递TTN-AS1可为胆管癌的治疗提供新的途径，并为研究胆管癌CTCs分泌的外泌体LncRNA TTN-AS1的生物学功能提供实验依据。

 

研究结果

1.成功培养CCA CTCs类器官细胞系

图1A：CTCs分离培养流程。

图1B：CTCs生长状况。

图1C：第5周初代CTCs类器官培养。

图1D：传代后的CTCs类器官细胞系。

图1E：正常尺寸的CTCs鉴定，直径≤20 μm,，DAPI和FITC阳性，CD45-PE阴性。

图1F：大尺寸CTCs鉴定，直径> 20 μm， DAPI和FITC阳性，CD45-PE阴性。

图1G：白细胞鉴定，DAPI和CD45-PE阳性，FITC阴性。

图1H：CTCs培养结果。

图1I：正常尺寸CTCs与大型CTCs的比例统计。

 

2. 外泌体鉴定

图2A：外泌体的粒径大小分布。

图2B：透射电镜观察外泌体呈现准圆形膜状囊泡。

图2C：Western blot分析外泌体中CD9、CD81和Calnexin蛋白的表达。

图2D：流式细胞术成像分析Huh28细胞对Dil标记外泌体的摄取情况，结果显示Huh28细胞有效地摄取了外泌体。

 

3.LncRNA的筛选与功能分析

图3A：火山图表示M组和CK组样本LncRNAs的差异表达。红点和蓝点分别表示上调和下调基因，灰点表示无统计学意义的基因。

图3B：层次聚类分析LncRNAs的差异表达，红色表示高表达，蓝色表示低表达。从蓝色到红色的颜色渐变表示 LncRNA表达水平的增加。

图3C：在生物过程、细胞成分和分子功能类别中，前30个GO富集分析中差异表达基因的分布。

图3D：条形图显示GO富集分析。

图3E：条形图显示KEGG富集分析。

图3(F)：散点图显示差异表达基因富集的KEGG通路。

 

4. CCA肿瘤组织、血液和血清外泌体LncRNA TTN-AS1的诊断价值

图4A：qRT-PCR检测QBC939和HIBEC细胞源性外泌体中LncRNA的表达。

图4B：qRT-PCR检测胆管癌细胞株中TTN-AS1的表达。

图4C：qRT-PCR检测胆管癌组织及癌旁组织中TTN-AS1的表达。

图4D：qRT-PCR检测胆管癌患者和健康人血液样本中TTN-AS1的表达。

图4E：qRT-PCR检测胆管癌患者和健康人血清外泌体中TTN-AS1的表达。

图4F：胆管癌患者肿瘤组织中TTN-AS1表达的ROC曲线。

图4G：胆管癌患者血样中TTN-AS1表达的ROC曲线。

图4H：胆管癌患者血清外泌体TTN-AS1表达的ROC曲线。

 

5. CTCs衍生的外泌体TTN-AS1可促进胆管癌细胞的增殖和迁移

图5A：与CTCs -外泌体共培养的Huh28细胞中TTN-AS1表达显著上调。

图5B：CTCs -外泌体促进Huh28细胞的生长。

图5C：CTCs -外泌体增强Huh28细胞的克隆形成能力。

图5D：CTCs -外泌体增加Huh28细胞中Cyclin D1 mRNA的表达。

图5E：CTCs -外泌体加速Huh28细胞的细胞周期进程。

图5F：CTCs -外泌体抑制Huh28细胞凋亡。

图5G：CTCs -外泌体推动Huh28细胞的迁移。

图5H：CTCs -外泌体促进Huh28细胞的迁移。

图5I：CTCs -外泌体共培养后Huh28细胞中EMT相关基因的表达。

图5J：CTCs -外泌体共培养后Huh28细胞中Cyclin D1和EMT相关蛋白的表达。

 

6. TTN-AS1缺乏、过表达和CTCs -exo对体内肿瘤的影响

图6A：测量肿瘤体积每天的变化情况。

图6B：各组切除肿瘤的照片。

图6C：各组切除肿瘤的平均重量。

图6D：qRT-PCR检测各组肿瘤组织中TTN-AS1的表达。

图6E：各组肿瘤组织HE染色及免疫组化分析。

 

结论

       本研究发现，血清外泌体中LncRNA TTN-AS1的诊断和预测价值超过组织和血液。胆管癌CTCs衍生的外泌体具有转运LncRNA TTN-AS1和促进胆管癌转移的能力。这些发现表明，来自CTCs的外泌体LncRNA TTN-AS1可能作为胆管癌诊断和治疗的潜在生物标志物。TTN-AS1通过CTCs外泌体的转移可能为针对胆管癌的治疗策略开辟新的途径。