惊爆！AD治疗重大发现！多靶点工程化外泌体成“救星”，10分+发文思路秒get！

阿尔茨海默病(AD)是一种不可逆的神经退行性疾病，目前，AD尚无有效的治疗方法，主要是因为其病理机制复杂。AD治疗的临床疗法仅对症状管理产生一定的益处，并不能有效防止神经元损失和认知能力下降。AD 疾病修饰治疗 (DMT) 的临床试验已发生多次失败。目前已有多种抗β-淀粉样蛋白DMT已上市，但它们只能减缓疾病进展，而不能显著改善认知功能。因此，AD 治疗应针对 Aβ 聚集体形成的根本原因以及 Aβ 以外的其他疾病机制。许多证据表明 AD 是由多种病理过程引发的，并且需要不止一种治疗。因此，能够同时调节多个靶点的多靶点策略对于治疗AD具有巨大潜力。

湾湾今天分享的是一篇发表在【J CONTROL RELEASE】（IF：10.5）上题为“Omnidirectional improvement of mitochondrial health in Alzheimer's disease by multi-targeting engineered activated neutrophil exosomes”的研究，该研究提出，多靶点工程化活化中性粒细胞外泌体可以改善神经元线粒体健康，对抗 Aβ 诱导的线粒体缺陷，防止 Aβ 产生和聚集，从而阻止 AD 进展。

 

研究成果

1. 活化的中性粒细胞与 AD 严重程度呈正相关，激活的中性粒细胞衍生的外泌体（AExo）早期阶段在 AD 小鼠的大脑中积累

图1活化的中性粒细胞参与了AD的发展，其衍生的外泌体（AExo）在阿尔茨海默病的早期阶段显著积累。

图1A：通过 Elisa 试剂盒测量血清中炎症细胞因子（IL-1β、TNF-α 和 IL-8）的循环水平。图1B：IL-8活性与队列中受试者的MMSE显著相关。

图1C-D：LFA-1亲和状态，用KIM127抗体检测低至中亲和状态(C)，用327A抗体检测高亲和状态(D)。

图1E：APP/PS1转基因小鼠3个月、7个月和22个月皮质层Gr-1 +中性粒细胞（红细胞）的共聚焦显微镜图像。

图1F：对图2E中突变小鼠和野生型对照 (WT ctrl) 中Gr-1 ⁺细胞数量的定量。

图1G：从用IL-8刺激的嗜中性粒细胞的上清液中纯化AExo。

图1H：通过蛋白质印迹法检测经IL-8刺激的活化中性粒细胞的质膜(PM)和胞浆中LFA-1的蛋白表达水平。

图1I：AExo和NEs-Exo的Exo标记（CD63）和中性粒细胞标记（LFA-1和IL-1R）的蛋白质印迹。

图1J：7月龄APP/PS1转基因小鼠皮质层DiR标记的AExo（红色）或NE-Exo的荧光图像。

这些结果表明，中性粒细胞可以穿过血脑屏障并积聚在AD小鼠发炎的脑部区域中。因此，目前 AD 治疗的障碍，如缺乏特异性、血脑屏障外显率差和靶向能力有限等，可以使用基于中性粒细胞的药物输送系统轻松解决。此外，图2J的结果还表明AExo可以在早期阶段在AD大脑中积累，这为AD的诊断和治疗带来了巨大的希望。

 

2. 多靶点工程AExo的制备和表征

图2 活化中性粒细胞衍生的外泌体 (MP@Cur-MExo)的制备和表征

图2A：示意图说明了多靶点工程化AExo (MP@Cur-MExo) 的制备。

图2B：MP@Cur-MExo 的 TEM 图像。

图2C：MP@Cur-MExo 中 Fe、O、N 和 C 元素的 EDX 映射。

图2D：MP@Cur-MExo 中 LFA-1、IL-1R 和 CD63 的蛋白表达。

图2E：线图显示48小时内PBS中的MP@Cur-MExo释放Cur。

图2F：MP@Cur-MExo的r1表征。插图显示了不同浓度的MP@Cur-MExo的T1图像。信号强度与MP@Cur-MExo浓度之间的线性关系暗示其作为显像剂的潜力。

图2G：不同处理下Aβ聚集的ThT荧光强度比(F/F0)的条形图。

以上数据表明成功建立的MP@Cur-MExo在AD多靶点治疗中具有巨大潜力。

 

3. 多重靶向工程AExo对Aβ诱导的线粒体功能障碍具有神经保护作用

图3通过多靶点工程AExo对Aβ诱导的线粒体功能障碍进行神经保护

图3A：共聚焦激光扫描成像显示Dil标记的外泌体在经Aβ预处理的HT22细胞线粒体中共定位。观察到 Dil 信号（红色）和线粒体染色的 Mitotracker（绿色）。

图3B：用不同制剂处理后，Aβ处理的HT22细胞中相对ATP产量的条形图。正常HT22细胞的ATP产量用作对照并设置为1。

图3C：用不同制剂处理的Aβ处理的HT22细胞中线粒体的TEM图像。Aβ处理的HT22细胞中的线粒体肿胀，呈圆形，线粒体嵴被破坏，而MP@Cur-MExo处理后Aβ处理的HT22细胞中的线粒体肿胀程度减轻，嵴组织良好。

图3D：不同处理后经Aβ处理的HT22细胞中LC3的免疫荧光成像。 MP@Cur-MExo 处理后，活化的 HT22 细胞中 LC3 水平（红色）受到抑制。

图3E：示意图说明 MP@Cur-MExo 通过多靶点治疗改善神经元线粒体健康。

以上结果表明，多靶点AExo（MP@Cur-MExo）可以被AD脑中过度表达的MMP-2裂解，并释放两种靶向治疗剂，用于AD的多靶点治疗。其中，释放的Cur-MExo可以减轻Aβ诱导的线粒体代谢缺陷并阻止Aβ产生。另一种治疗剂MK-SPION可以抑制细胞外Aβ沉积和聚集，从而协同保护神经元免受Aβ毒性。因此，MP@Cur-MExo可以潜在地改善Aβ损伤神经元的线粒体功能（图3E）。因此，多靶点 AExo 是减缓体内 AD 进展的有希望的候选者。

 

4. 多靶点工程AExo在AD小鼠体内具有脑靶向能力

图4 MP@Cur-MExo在AD模型小鼠中的靶向能力

图4A：示意图显示MP@MExo对早期AD模型小鼠的大脑靶向能力。

图4B：用DiR标记的MP@MExo治疗后AD小鼠的体内成像。

图4C：用DiR标记的MP@MExo治疗后AD小鼠大脑相对荧光强度 (FL) 的条形图。

图4D：注射后24小时后大脑和主要器官的离体成像。AD小鼠被静脉注射DiR标记的制剂，并收获主要器官和AD并进行成像。

图4E：AD小鼠注射DiR标记的MP@MExo后大脑的CLSM图像。

图4F：MP@MExo治疗后AD小鼠大脑的T1图像。圆圈表示海马体。

图4G：MP@MExo治疗后AD小鼠脑区的相对T1强度。以MP治疗后AD小鼠脑组织的T1强度作为对照并设置为1。

图4H：MP@MExo治疗后AD小鼠脑区的普鲁士蓝染色。

这些结果证实了多靶点工程AExo在小鼠AD早期阶段具有良好的脑靶向性，表明它们可以通过双模态（MRI/IVIS）成像在体内诊断AD。

 

5. 通过多靶点工程AExo缓解AD小鼠的记忆衰退

图5通过多靶点工程AExo缓解AD小鼠的记忆衰退

图5A：示意图说明多靶向工程 AExo 治疗可减轻模型小鼠的AD。

图5B-C：AD模型小鼠大脑中Aβ斑块的免疫组织化学染色 (B) 和半定量分析 (C) 的代表性图像。

图5D：通过MWM测试评估空间记忆。MWM测试的训练和测试阶段的代表性视频跟踪图像（上图）和热图摘要（下图）。

图5E：NOR测试中的代表性热图。

图5F：皮质和海马顶树突棘和基底树突棘的高尔基染色。

图5G：经过不同处理的AD小鼠海马线粒体中LC3和P62的免疫荧光。

图5H：接受不同治疗的AD小鼠海马线粒体的TEM图像。

这些结果表明MP@Cur-MExo具有良好的生物安全性和生物相容性，是一种有前途的AD治疗药物。

 

结论

该研究建立了一种多靶点工程化AExo (MP@Cur-MExo)，它专门针对 AD 大脑响应炎症，并选择性释放细胞内和细胞外靶向治疗剂 (Cur-MExo和MKSPION) 以响应MMP-2过表达在AD微环境中。更重要的是，Cur-MExo通过LFA-1和MK-SPION有效结合Aβ沉积物，靶向AD大脑中激活的神经元，从而通过双模态 (MRI/IVIS) 成像实时显示AD发炎切片。体外研究表明，通过抑制线粒体自噬，激活神经元的线粒体代谢得以恢复，从而有效改善线粒体健康。多靶点工程化AExo有效改善AD小鼠的记忆和认知功能。这项工作表明，改善线粒体健康的多靶点治疗可能是延缓AD进展的一种有前景的策略，并且已建立的 MP@Cur-MExo在临床实践中具有治疗AD的巨大潜力。