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嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法彻底改变了造血系统恶性肿瘤的治疗方式。然而，它们在治疗实体癌方面的疗效却令人存疑。实体癌中有效CAR-T细胞治疗的主要障碍包括CAR-T细胞向肿瘤的浸润有限、不利的肿瘤微环境（TME）以及T细胞衰竭。此外，与血液系统恶性肿瘤不同（其中癌细胞通常表达特定的表面标志物），实体瘤表达肿瘤相关抗原，而这些抗原在正常组织中的表达水平较低。靶向肿瘤但产生脱靶毒性的风险很高，Her2-CART细胞和GD2-CART细胞临床试验中的灾难性毒性就说明了这一点。对于实体瘤，明显存在对更好的细胞疗法未被满足的临床需求。

细胞外囊泡（sEVs）是纳米级的囊泡，在体液中相对稳定，能够穿越生物屏障到达特定部位。sEVs具有其亲代细胞的许多特征，并表现出出色的生物相容性。来自细胞毒性免疫细胞的sEVs会将穿孔素、溶菌酶和其他细胞毒性分子携带至癌细胞。然而，未修饰的免疫细胞来源的sEVs缺乏肿瘤靶向能力。CAR-T细胞释放的sEVs表面具有CAR，并且在临床前模型中已显示出对某些癌症有良好的靶向和治疗效果。

湾湾今天分享的是发表在【ScienceAdvances】（IF：11.7）上题为“EngineeredextracellularvesicleswithDR5agonisticscFvssimultaneouslytargettumorandimmunosuppressivestromalcells”的研究，该研究在源自自然杀伤细胞的sEVs表面构建了DR5激动性单链可变片段（scFvs）的表达。血小板衍生生长因子受体跨膜结构域将DR5-scFvs传递到sEVs表面。DR5-scFvsEVs能迅速诱导不同类型的DR5+癌细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和癌症相关成纤维细胞（CAFs）的凋亡。DR5-scFvsEVs在体外和体内都能特异性迁移到DR5+肿瘤。全身性给予DR5-scFvsEVs显著抑制DR5+黑色素瘤、肝癌和乳腺癌的生长，延长小鼠寿命，且无明显毒性。在体内，DR5-scFvsEVs比DR5抗体更有效。在器官型患者来源的黑色素瘤切片培养中，DR5-scFvsEVs能有效抑制黑色素瘤细胞和MDSCs，并激活CD8+T细胞。该研究表明，DR5-scFvsEVs可通过靶向肿瘤微环境（TME）中的肿瘤细胞和免疫抑制基质细胞来抑制肿瘤生长。

 

研究结果

1.DR5-scFvs诱导DR5+肿瘤细胞凋亡

 

图1A：不同细胞类型中DR5的表达。从不同细胞中提取蛋白质，并使用抗DR5抗体进行westernblo t分析。

图1B：DR5在黑色素瘤细胞中高表达。使用原位杂交检测正常皮肤（左图）和黑色素瘤（右图）中DR5mRNA的表达。

图1C：DR5–4-1BBzCAR和DR5-PDGFR慢病毒载体的示意图。

图1D-E：DR5CAR-T细胞在体内对肿瘤的影响。通过将A375细胞皮下注射到裸鼠右侧腹部建立黑色素瘤异种移植模型（n=5）。未转染的T（UTD）细胞或DR5-scFvCAR-T细胞（每次注射2.5×10^6个）通过瘤内注射（D）或尾静脉注射（E）注入小鼠体内。

图1F：转染的SupT1细胞中CARscFv的表达。用CD19-CAR或DR5-CAR慢病毒载体转染SupT1细胞。使用流式细胞术检测SupT1细胞中CD19-scFvs或DR5-scFv的表达。

图1G：DR5-CARSupT1细胞或CD19-CARSupT1细胞对A375细胞的荧光素酶杀伤测定。将A375细胞用DR5-CARSupT1细胞或CD19-CARSupT1细胞以指定的效应细胞与靶细胞比例（E:T比例）处理。

图1H：DR5-CARSupT1细胞诱导A375细胞凋亡。用野生型（WT）、CD19-CAR或DR5-CAR转染的SupT1细胞处理的A375细胞进行膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（FITC）/PI染色。

以上结果表明，DR5激动性scFvs对靶细胞有直接的细胞毒性。

 

2.PDGFR-TM增加了sEVs中DR5-scFvs的表面表达

 

图2A：NK92细胞中DR5-scFv的表达。用DR5–4-1BBz或DR5-PDGFR慢病毒载体转染NK92细胞。对DR5-scFv阳性细胞进行分选和培养。使用流式细胞术分析NK92细胞中DR5-scFv的表达。

图2B：不同载体转染不影响NK92细胞的增殖。在指定时间点计数对照组、DR5-BBz-NK92和DR5-PDGFR-NK92细胞的数量。

图2C-D：使用NanoSightNS300对sEVs进行纳米颗粒跟踪分析。来自对照组、DR5–4-1BBz–NK92或DR5-PDGFR-NK92细胞的sEVs大小分布的代表性图像和柱状图。

图2E：Westernblot检测NK92细胞全细胞裂解液（WCL）和NK92细胞来源的sEVs中的sEV标志物CD9、CD81、TSG101和内质网标志物钙连蛋白。

图2F：工程化sEVs的TEM图像。用抗DR5-scFvs的金结合抗体标记sEVs。

图2G：不同类型NK92来源的sEVs的磁珠流式细胞术分析。柱状图显示了不同组中DR5-scFv阳性sEVs的百分比。

以上结果表明，在将DR5-scFv传递到sEVs表面方面，PDGFR跨膜结构域优于CD8跨膜结构域。

 

3.DR5-scFvsEVs以剂量和DR5表达依赖的方式对肿瘤细胞表现出细胞毒性

 

图3A-F：DR5-scFvsEVs在不同细胞中的荧光素酶杀伤测定。用对照、DR5-BBz和DR5-PDGFR-NK92细胞来源的0、2.5、5或10μg的EVs处理A2058（A）、UACC-903（B）、A375-WT（人黑色素瘤细胞系）（C）、BJ（人成纤维细胞系）（D）、HaCaT（人角质形成细胞系）（E）和SK-Mel-28（人黑色素瘤细胞系）（F）。

图3G：用DR5-scFvsEVs处理的A375-GFP细胞的代表性图像。A375-GFP细胞（绿色）用DR5-scFvsEVs（深红色）处理3小时。这些细胞用PI（红色）和Hoechst33342（蓝色）染色。在指定时间点拍摄图像。

图3H：不同上皮癌细胞系中DR5的表达。从不同细胞中提取蛋白质，并使用抗DR5抗体进行westernblot分析。

图3I-L：DR5-scFvsEVs在不同癌细胞中的荧光素酶杀伤测定。用对照、DR5–4-1BBz和DR5-PDGFR-NK92细胞来源的0、2.5、5或10μg的sEVs处理Huh-7（人肝癌细胞）（I）、OVCAR-5（人卵巢癌细胞）（J）、MDA-MB-231（人乳腺癌细胞）（K）和PANC-1（人胰腺癌细胞系）（L），并进行荧光素酶测定。

图3M：NK92细胞和NK92-sEVs中蛋白质的变异系数图。使用491种抗体进行RPPA。

 

4.DR5-scFvsEVs对高DR5表达的黑色素瘤细胞具有特异性

 

图4A-D：在A375和Huh-7细胞中使用tigatuzumab和DR5-scFvsEVs进行的荧光素酶杀伤测定。用等量的DR5抗体分子或sEVs中的DR5-scFvs处理A375（A、B）和Huh-7（C、D）细胞。

图4E：通过尾静脉向裸鼠注射低剂量DR5抗体（5ng）、高剂量DR5抗体（4.6μg）或DR5-scFvsEVs（每只小鼠100μg）。每周治疗两次。在指定时间点测量肿瘤体积。

图4F：对A375-DR5WT和A375-DR5KO细胞的蛋白质进行westernblot分析。使用CRISPR/Cas9敲除了A375中的DR5。

图4G：DR5-scFvsEVs诱导黑色素瘤细胞凋亡。用指定的sEVs处理A375-DR5WT和A375-DR5KO细胞24小时，并用PI染色。柱状图显示了PI阳性黑色素瘤细胞的百分比。

图4H-J：DR5-scFvsEVs在高DR5表达细胞中诱导的凋亡多于低DR5表达细胞。将A375-DR5WT（无GFP标签）和A375-DR5KO（有GFP标签）细胞（H），或UACC-903（无GFP标签）和SK-Mel-28（有GFP标签）细胞（I）混合，并与10μg的DR5-scFvsEVs或对照sEVs孵育24小时。进行PI（红色）和Hoechst33342（蓝色）染色。

图4J：死亡细胞百分比的柱状图。

图4K：DR5-scFvsEVs优先结合DR5野生型细胞。用深红色染料（红色）标记DR5-scFvsEVs。将A375-DR5WT（无GFP标签）和A375-DR5KO（有GFP标签）细胞与预先染色的DR5-scFvsEVs孵育2小时。拍摄A375细胞摄取DR5-scFvsEVs的代表性图像。

以上结果表明，在控制肿瘤生长方面，DR5-scFvsEVs比DR5单克隆抗体具有优势。

 

5.DR5-scFvsEVs迁移至DR5+黑色素瘤并在体内抑制肿瘤生长

 

 

图5A：通过将A375-DR5WT细胞皮下注射到NSG小鼠的右侧腹部，将A375-DR5KO细胞注射到左侧腹部来建立黑色素瘤异种移植小鼠模型。在指定时间通过尾静脉向小鼠注射预先染色的对照sEVs或DR5-scFvsEVs（每只小鼠100μg，红色）。

图5B：在指定时间点肿瘤和标记的sEVs的代表性图像。使用荧光素对肿瘤进行成像。

图5C：不同组的平均荧光强度柱状图。

图5D-G：DR5-scFvsEVs在体内抑制黑色素瘤肿瘤生长。向小鼠瘤内（D）或通过尾静脉（E-G）注射DR5-scFvsEVs（每只小鼠100μg）或等量的PBS。（D-E）在指定时间点测量肿瘤体积。（F）三组小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。（G）DR5-scFvsEVs诱导黑色素瘤细胞凋亡。

图5H-M：DR5-scFvsEVs在体内抑制多种不同类型的肿瘤生长。通过将WM4625.2brm、MDA-MB-231brm或Huh-7细胞皮下注射到裸鼠的右侧腹部来建立异种移植小鼠模型。通过尾静脉（静脉内）向小鼠注射DR5-scFvsEVs（每只小鼠100μg）或等量的PBS。在指定时间测量肿瘤体积。（K-M）不同组荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存曲线。

以上结果表明，DR5-scFvsEVs在体内优先迁移到DR5+肿瘤细胞，并且肿瘤微环境（TME）不会阻止sEVs的进入。此外，DR5-scFvsEVs显著抑制了这些肿瘤的生长并延长了治疗小鼠的存活时间。

 

6.DR5-scFvsEVs靶向黑色素瘤中的MDSCs和CAFs

 

 

图6A-C：通过免疫组织化学检测发现，在黑色素瘤患者组织中，DR5在黑色素瘤细胞（A）、MDSCs（B）和CAFs（C）中高表达。

图6D-E：DR5-scFvsEVs对MDSCs表现出细胞毒性。通过GM-CSF和IL-6诱导MDSCs，并使用指定的sEVs处理24小时。（D）流式细胞术图显示了不同组中CD33+CD11b+细胞的百分比。（E）指定sEVs对MDSCs的杀伤测定。

图6F-G：DR5-scFvsEVs在器官型患者来源的黑色素瘤组织切片中杀死MDSCs。获得黑色素瘤的组织切片并用sEVs处理。显示了CD33+CD11b+MDSC的流式细胞术图（F）和不同组中CD33+CD11b+活细胞百分比的柱状图（G）

图6H：在由CCD19-Lu细胞诱导的CAFs中，DR5高表达。生成人工诱导的CAFs。从细胞中提取蛋白质，并使用抗DR5抗体进行免疫印迹分析。β-肌动蛋白用作对照。

图6I-J：使用DR5-scFvsEVs的CAF杀伤测定。对照CCD19-Lu细胞（I）和诱导的CAFs（J）用对照、DR5-BBz-NK92和DR5-PDGFR-NK92细胞来源的0、2.5、5或10μg的sEVs处理。

以上结果表明，DR5-scFvsEVs对MDSCs和CAFs具有细胞毒性。

 

7.DR5-scFvsEVs重编程黑色素瘤中的肿瘤微环境

 

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图7A：DR5-scFvsEVs诱导黑色素瘤组织切片中的细胞凋亡。对sEV处理的肿瘤切片进行膜联蛋白V凋亡测定。展示了对照或DR5-scFvsEV处理的黑色素瘤切片中凋亡细胞的代表性流式细胞术图。

图7B-D：DR5-scFvsEVs增强患者来源的黑色素瘤组织切片中CD8+T细胞的功能。CD3+细胞中CD8+T细胞百分比（B）、CD8+T细胞中颗粒酶B（C）和Ki-67（D）百分比的代表性流式细胞术图。

图7E：来自八位患者的不同黑色素瘤切片中凋亡细胞的柱状图。

图7F-H：不同组中CD3+细胞中CD8+T细胞百分比（F）、CD8+T细胞中颗粒酶B（G）和Ki-67（H）百分比的柱状图。

图7I：DR5-scFvsEVs重编程肿瘤微环境的示意图，其可能被开发为一种新型癌症疗法。

 

结论

综上，该研究开发了表达高水平DR5-scFvs的工程化sEVs。这些武装的sEVs特异性地靶向DR5+肿瘤细胞、MDSCs和CAFs。对这些细胞的抑制减轻了免疫抑制性肿瘤微环境，使其他免疫细胞。本研究的结果表明，工程化的DR5-scFvsEVs代表了一种有前途的癌症免疫治疗策略。有可能用不同的scFvs来武装sEVs以靶向各种癌症，使其成为一种通用的现成平台技术，可适用于治疗实体癌。