IF：10+，生物细胞学前沿大瓜！桔梗外泌体成急性肺损伤治疗“潜力股”？快来一探究竟！

急性肺损伤（ALI）是一种严重的呼吸系统疾病，死亡率高达40%，目前全球尚无有效临床治疗方法。新鲜药用植物在治疗炎症性疾病方面比干燥形式更具疗效，桔梗（PG）作为经典中药材，在治疗肺部疾病方面有悠久历史，但以往对其新鲜形式的研究较少。纳米技术在生物医学领域的应用备受关注，植物来源的外泌体样纳米颗粒（如桔梗外泌体样纳米颗粒，PGLNs）有望为探索新鲜草药的物质基础和机制提供方向。

 

​今天分享的是发表在【J Nanobiotechnology】（IF：10.6）上题为“Platycodon grandiflorum exosome-like nanoparticles: the material basis of fresh platycodon grandiflorum optimality and its mechanism in regulating acute lung injury”的研究，本研究旨在探讨新鲜PG对ALI小鼠的治疗效果，分析PGLNs的特性、生物相容性及其治疗ALI的机制。

 

研究结果

1、新鲜PG在减轻LPS诱导的小鼠ALI方面比干燥PG具有更好的治疗效果

 

图1A：LPS和PG（PF、PFW、PD、PDW）在ALI模型小鼠中的给药方案。

图1B：显示了各组小鼠在接受PF、PFW、PD和PDW治疗7天内的体重变化。结果表明，LPS干预后小鼠体重显著下降，而新鲜PG（PF）治疗能显著缓解体重下降情况，干燥PG（PD）治疗也有一定改善，但不如PF明显。

图1C：呈现了各组小鼠肺泡灌洗液中的蛋白质浓度。PF和PD治疗均显著降低了LPS诱导的ALI小鼠肺泡灌洗液中的总蛋白含量，说明PG（新鲜或干燥）能有效减轻炎症渗出。

图1D：展示了各组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平。PF和PD治疗均显著降低了这些促炎因子的mRNA表达水平。

图1E：为各组小鼠肺切片的HE染色结果。LPS刺激导致肺泡壁增厚、肺间质水肿、肺泡出血、肺泡腔塌陷和大量炎症细胞浸润；PF治疗显著改善了肺组织结构和炎症细胞浸润，PD治疗虽有改善，但仍可见肺泡出血、间质水肿等炎症损伤。

这些结果表明，新鲜或干燥的PG干预均可显著修复LPS刺激后的肺炎症损伤，改善肺病理变化，且新鲜PG的治疗效果更好。

 

2、PGLNs的分离和表征

图2A：展示了通过差速离心和蔗糖密度梯度离心制备PGLNs的过程。

图2B：透射电镜（TEM）图像显示，PGLNs呈圆形或椭圆形囊泡，具有双层膜结构，平均直径为90nm，符合外泌体样纳米颗粒的一般特征。

图2C：纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测结果显示，PGLNs的平均粒径分布为141.2nm，颗粒含量较高（平均为1.4×10⁸particles/mL）。

图2D：PGLNs的Zeta电位为-23.5mV，表明其具有良好的稳定性和分散性。

图2E：琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，PGLNs含有核酸相关物质。

图2F：SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测结果表明，PGLNs含有蛋白质相关物质。

图2G：BCA法测定PGLNs的蛋白质浓度结果显示，新鲜PGLNs的浓度约为4.0mg/mL，每50g新鲜PG可获得1mLPGLNs，产量较高。

这些结果表明，成功分离和纯化出了PGLNs，其具有纳米级尺寸、囊泡样结构，且含有核酸和蛋白质等物质，产量较高。

 

3、PGLNs的蛋白质组学表征

图3A：直方图展示了PGLNs中检测到的总蛋白数量，共检测到112种蛋白质成分。

图3B：显示了PGLNs中总蛋白的分子量分布，约70%的蛋白质分子量在0-80kDa，约30%大于80kDa。

图3C：展示了PGLNs中总蛋白的亚细胞定位，37种蛋白质位于细胞质，15种位于质膜。

图3D：基于PGLNs蛋白质组学的GO功能分析结果表明，PGLNs含有多种与膜成分相关的蛋白质，参与信号转导和各种代谢途径。

图3E：KEGG分析结果进一步突出了PGLNs的囊泡样特征及其可能的药效物质基础。

这些结果表明，PGLNs含有多种具有不同分子质量和生物学功能的蛋白质，在信号转导和代谢途径中发挥作用，为其潜在的药效提供了物质基础。

 

4、PGLNs的生物安全性评估

图4A：不同浓度PGLNs（1000、500、100、50、10µg/mL）对红细胞的溶血活性检测结果显示，所有浓度的PGLNs溶血活性均较低，为PGLNs的静脉给药提供了依据。

图4B：细胞活性检测结果表明，RAW264.7细胞在与不同浓度PGLNs孵育24小时后，细胞活性均有所增加，说明PGLNs可促进RAW264.7细胞增殖。

图4C：小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺和肾脏组织切片的H&E染色结果显示，PGLNs组与对照组相比，组织形态无明显病理变化，表明PGLNs具有良好的生物安全性。

图4D：不同浓度PGLNs干预斑马鱼受精卵1天后的结果显示，斑马鱼幼虫形态与对照组相比无显著差异，未观察到异常表型，表明PGLNs在测试浓度下无明显毒性。

这些结果表明，PGLNs具有良好的生物相容性，为其作为天然药物制剂的给药提供了安全基础。

 

5、PGLNs减轻LPS诱导的小鼠ALI，这可能与调节巨噬细胞极化有关

图5A：展示了LPS和PGLNs在ALI小鼠中的给药方案示意图。

图5B：LPS组和LPS+PGLNs组小鼠体重差异结果显示，LPS刺激后小鼠体重显著下降，PGLNs干预后体重下降明显缓解。

图5C：各组小鼠肺组织的宏观图像显示，LPS刺激后肺组织明显充血、水肿，体积增大；PGLNs干预后，肺组织的充血和水肿得到明显改善。

图5D：BCA法检测小鼠肺泡灌洗液中蛋白质浓度结果表明，LPS刺激后肺泡灌洗液中总蛋白含量显著升高，PGLNs干预后明显降低。

图5E：RT-qPCR检测小鼠肺组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β1的mRNA水平结果显示，PGLNs显著下调了促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平，上调了TGF-β1的mRNA表达水平。

图5F：小鼠肺切片的H&E染色结果显示，LPS刺激导致肺组织结构明显紊乱，肺泡壁增厚，肺泡腔狭窄或消失，伴有大量渗出和炎症细胞浸润；PGLNs治疗显著减轻了这些病理变化。

图5G：组织免疫荧光检测小鼠肺组织中M1促炎巨噬细胞标志物CD86的荧光表达结果显示，LPS刺激下CD86荧光强度较高，PGLNs干预后显著降低。

图5H：组织免疫荧光检测小鼠肺组织中M2抗炎巨噬细胞标志物CD206的荧光表达结果显示，LPS刺激下CD206荧光强度较低，PGLNs干预后显著升高。

这些结果表明，PGLNs治疗可修复炎症损伤，改善小鼠肺组织的病理变化，对LPS诱导的小鼠ALI具有保护作用，且这种保护作用可能与调节巨噬细胞极化有关。

 

6、PGLNs在体外调节巨噬细胞极化

图6A：共聚焦图像显示，PKH67标记的PGLNs与RAW264.7细胞显著共定位，大部分PGLNs荧光位于细胞骨架内，表明RAW264.7细胞可有效摄取PGLNs。

图6B：不同浓度LPS诱导RAW264.7细胞24小时后的活性检测结果显示，LPS不同程度地抑制了RAW264.7细胞的活性，后续实验采用1µg/mLLPS构建炎症细胞模型。

图6C：RT-qPCR检测结果显示，PGLNs显著降低了LPS刺激的细胞模型中促炎因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平，增加了IL-10的mRNA表达水平，表明PGLNs可有效改善LPS诱导的炎症细胞损伤。

图6D：RT-qPCR检测结果显示，PGLNs显著降低了M1促炎细胞标志物iNOS的mRNA表达水平，增加了M2抗炎细胞标志物Arg-1的mRNA表达水平。

图6E：细胞免疫荧光结果显示，LPS刺激下M1促炎细胞标志物CD86的荧光强度显著增强，M2抗炎细胞标志物CD206的荧光强度不明显；PGLNs干预后，荧光强度变化趋势相反。

图6F：流式细胞术分析结果显示，PGLNs可调节RAW264.7细胞的极化，与上述结果趋势一致。

这些结果表明，PGLNs能有效被RAW264.7细胞摄取，并调节细胞极化，抑制炎症反应，改善LPS诱导的炎症细胞损伤。

 

7、PGLNs影响LPS诱导的RAW264.7细胞的代谢紊乱

图7A：展示了代谢组学分析的流程示意图。

图7B：通过与代谢组学数据库对比，共鉴定出1588种物质，包括脂质、有机酸、有机杂环化合物等多种类别。

图7C：PCA得分图显示所有样本均分布在95%置信区间内，表明PCA模型可靠，可用于分析样本间的差异。

图7D：PCA得分图显示对照组与LPS组、LPS组与LPS+PGLNs组之间存在明显分离，表明各组代谢存在差异。

图7E：OPLS-DA得分图进一步显示了各组之间的差异，且OPLS-DA置换检验结果（图7F）表明该模型具有良好的拟合度和预测能力。

图7G：聚类分析热图显示，PGLNs干预可影响LPS诱导的RAW264.7细胞的代谢紊乱。

这些结果表明，PGLNs干预能够影响LPS诱导的RAW264.7细胞的代谢紊乱。

 

8、LPS和LPS+PGLNs处理后RAW264.7细胞中差异代谢物的分析

图8A：PCA得分图显示Convs.LPS组和LPSvs.LPS+PGLNs组之间差异显著分离，样本聚类在一起。

图8B：OPLS-DA得分图进一步展示了不同组间差异代谢物的分布情况。

图8C：OPLS-DA置换检验结果表明不同组间差异显著。

图8D：结合P值和代谢物差异幅度可视化了组间代谢物变化的变异性。

图8E：聚类分析热图显示Convs.LPS组和LPSvs.LPS+PGLNs组的代谢物存在显著差异。

图8F：Convs.LPS组差异代谢物KEGG富集因子气泡图显示，LPS发挥作用的机制主要与嘌呤代谢、嘧啶代谢等途径相关。

图8G：LPSvs.LPS+PGLNs组差异代谢物KEGG富集因子气泡图显示，PGLNs调节的差异主要与亚油酸代谢、初级胆汁酸生物合成等途径相关。

这些结果表明，PGLNs通过不同的代谢中间产物调节LPS诱导的RAW264.7细胞的代谢异常。

 

9、Convs.LPS和LPSvs.LPS+PGLNs的差异代谢物聚类热图

图9A：Convs.LPS组差异代谢物主要富集在生物碱及其衍生物、苯类化合物、核苷、核苷酸及其类似物、有机酸及其衍生物和有机氮化合物等。

图9B：LPSvs.LPS+PGLNs组差异代谢物主要富集在苯类化合物、脂质和类脂分子、核苷、核苷酸及其类似物、有机酸及其衍生物、有机氧化合物和有机杂环化合物等。

这些结果表明，LPS刺激和PGLNs干预导致的RAW264.7细胞代谢物变化存在显著差异，且涉及不同的代谢物类别和代谢途径。

 

10、PGLNs治疗LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的潜在生物标志物

图10A：PCA得分图展示了潜在生物标志物在Con、LPS和LPS+PGLNs组间的分布情况。

图10B：聚类分析热图显示LPS和LPS+PGLNs组间代谢物水平存在显著差异，且LPS+PGLNs组有恢复到Con组水平的趋势。

图10C：Convs.LPS组潜在生物标志物的差异倍数分析结果显示，各代谢物变化情况不同。

图10D：LPSvs.LPS+PGLNs组潜在生物标志物的差异倍数分析结果显示，PGLNs干预后，LPS刺激引起的52种代谢物异常均有不同程度的逆转，其中D-葡萄糖胺的差异倍数较高。

这些结果表明，PGLNs能在不同程度上纠正LPS诱导的RAW264.7细胞中异常的代谢物水平。

 

11、PGLNs治疗LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的关键代谢物分析

图11A：潜在生物标志物的KEGG富集图展示了相关代谢途径。

图11B：潜在生物标志物的代谢途径富集信息表明，PGLNs的代谢生物标志物主要涉及甘油磷脂代谢、维生素B6代谢等多种代谢途径。

图11C：对PGLNs干预后细胞中13种潜在代谢物的变化进行了定量分析。

这些结果表明，PGLNs可能通过调节氨基酸和脂质代谢、糖酵解途径等代谢途径，调节巨噬细胞极化，从而减轻肺部炎症。

 

12、PGLNs药理机制的代谢途径关系图

图12：展示了PGLNs可能通过调节氨基酸和脂质代谢、糖酵解途径等，调节巨噬细胞极化，进而减轻肺部炎症的代谢途径关系。该图直观呈现了PGLNs发挥药理作用的潜在代谢途径关联，为理解其治疗机制提供了依据。

 

结论

该研究表明，新鲜PG比干燥PG具有更好的抗炎和修复效果。从新鲜PG中提取的PGLNs在体内外均能改善炎症，首次揭示PGLNs可抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症，减轻LPS诱导的小鼠ALI。PGLNs可促进M2抗炎巨噬细胞的表达，抑制M1促炎巨噬细胞的表达，并在体外调节巨噬细胞代谢，包括糖酵解、脂质和氨基酸代谢途径。这些发现为PGLNs的治疗应用提供了系统的认识。