Bioact Mater|告别单一靶点！双外泌体+微流控递送+三重miRNA通路，协同抗炎修复，OA多靶点干预太顶了！

骨关节炎（OA）是一种慢性退行性关节疾病，以疼痛、活动受限和关节畸形为主要特征，严重影响患者生活质量，全球受累人群超6.5亿，我国约有1.32亿患者。OA病理机制复杂，涉及慢性炎症、合成代谢抑制、软骨退变等多重微环境紊乱，单一治疗手段难以实现全面的软骨保护功能。近年来，生物治疗在OA领域备受关注，但现有研究多聚焦于单一靶点，疗效不尽如人意。骨髓间充质基质细胞（BMSCs）和软骨祖细胞（CPCs）作为两种具有修复潜力的细胞，分别在抗炎调节和软骨生成方面展现出独特优势，其分泌的外泌体（Exo）继承了亲本细胞的核心生物学功能，且无直接细胞移植的免疫原性和致瘤性风险。

 

今天分享的是发表在【Bioact Mater】（IF:20.3）上题为“Harnessing bi-exosome combination alleviates osteoarthritis progression”的研究。该研究基于两种外泌体的功能差异，提出“双外泌体组合”策略，将抗炎导向的BMSC来源外泌体（B-Exo）与抗分解代谢导向的CPC来源外泌体（C-Exo）联合，通过透明质酸甲基丙烯酰微球递送至关节腔，同时调控巨噬细胞极化和软骨细胞表型，为OA治疗提供新型多靶点干预方案。

 

研究思路

首先通过RNA测序鉴定B-Exo和C-Exo的miRNA富集特征，明确二者分别侧重巨噬细胞调控和软骨细胞调节的功能差异；随后在体外验证两种外泌体单独及联合使用对软骨细胞（CCs）和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的作用，优化组合比例；接着利用微流控技术构建负载双外泌体（BC-Exo）的透明质酸甲基丙烯酰（HAMA）微球，表征其理化性质、缓释效果及生物安全性；在OA大鼠模型中评估该递送系统的体内治疗效果，包括疼痛缓解、关节功能改善、软骨保护及炎症抑制；最后通过转录组分析结合miRNA靶点验证，揭示双外泌体组合缓解OA进展的核心分子通路，为其临床应用提供理论支撑。

 

研究结果

1、B-Exo与C-Exo的miRNA富集特征对比

图1A：研究假设示意图，提出B-Exo（抗炎）与C-Exo（抗分解代谢）联合通过多靶点调控缓解OA进展。

图1B：BMSCs和CPCs的成骨、成脂、成软骨分化定量分析，BMSCs成骨和成脂能力分别为CPCs的7.04倍和1.44倍，CPCs成软骨能力为BMSCs的1.45倍。

图1C：Western blot检测显示，B-Exo和C-Exo均高表达外泌体标志物CD63、TSG101，不表达钙连蛋白CALNEXIN（细胞杂质标志物）。

图1D：透射电镜（TEM）显示，B-Exo和C-Exo均呈典型结构。

图1E：火山图显示，与B-Exo相比，C-Exo中有18个miRNA差异表达，其中5个上调、13个下调。

图1F：热图展示B-Exo与C-Exo中差异表达miRNA的具体分布特征。

图1G：KEGG通路分析显示，B-Exo富集miRNA的靶基因主要涉及MAPK、TNF等炎症相关通路，C-Exo富集miRNA的靶基因则关联Hippo、mTOR等软骨代谢相关通路。

图1H：GO富集分析显示，B-Exo相关miRNA参与巨噬细胞迁移抑制、MHCⅡ类蛋白复合物结合等功能，C-Exo相关miRNA涉及细胞外基质（ECM）组织、炎症反应调控等过程。

这些结果表明，B-Exo和C-Exo具有不同的miRNA富集特征，分别倾向于调控炎症反应和软骨细胞代谢，为二者联合应用提供了分子基础。

 

2、B-Exo与C-Exo对体外培养CCs和BMDMs的作用分析

图2A：实验示意图，分别用促炎因子联合外泌体处理CCs（i）和BMDMs（ii）。

图2B：细胞迁移实验显示，IL-1β诱导后CCs迁移能力下降，B-Exo和C-Exo处理均能显著提升迁移率。

图2C：CCK-8实验显示，C-Exo处理组CCs增殖活性在培养3-7天均显著高于B-Exo组。

图2D：qRT-PCR显示，IL-1β诱导后CCs中Sox-9和Col-Ⅱ基因表达降低，C-Exo处理后二者转录水平分别比B-Exo组高33.31%和22.21%。

图2E：流式细胞术显示，IL-1β诱导CCs凋亡率从2.97%升至8.53%，C-Exo组凋亡率（4.47%）显著低于B-Exo组（7.09%）。

图2F：免疫荧光染色显示，LPS+IFN-γ诱导后，B-Exo组iNOS⁺（M1标志物）巨噬细胞数量显著减少，ARG-1⁺（M2标志物）巨噬细胞数量显著增加，效果优于C-Exo组。

这些结果表明，C-Exo在促进软骨细胞增殖、ECM合成及抑制凋亡方面更具优势，而B-Exo在调控巨噬细胞向抗炎M2表型极化方面效果更显著。

 

3、双外泌体组合（BC-Exo）在体外对CCs保护及BMDMs极化的调控作用

图3A：BC-Exo组合效应示意图，展示其整合B-Exo抗炎功能与C-Exo软骨保护功能的协同作用。

图3B：共聚焦成像显示，DiI标记的B-Exo（红色）和DiO标记的C-Exo（绿色）均能被CCs和BMDMs有效摄取。

图3C：Western blot显示，IL-1β诱导后CCs中SOX-9蛋白表达降低，BC-Exo处理组SOX-9水平显著高于B-Exo组，仅低于C-Exo组。

图3D：Western blot显示，C-Exo和BC-Exo处理组CCs中抗凋亡蛋白BCL-2表达显著上调，分别比B-Exo组高58.58%和51.5%。

图3E：Western blot显示，LPS+IFN-γ诱导后，B-Exo和BC-Exo组巨噬细胞中iNOS、CD86（M1标志物）蛋白表达显著降低，ARG-1、CD206（M2标志物）蛋白表达显著升高，效果优于C-Exo组。

图3F：qRT-PCR显示，BC-Exo组CCs中Acan基因表达分别为B-Exo组的1.31倍和C-Exo组的1.29倍，MMP-13（分解代谢标志物）基因表达显著降低。

图3G：qRT-PCR显示，BC-Exo组巨噬细胞中CD86基因表达显著降低，CD163、IL-10（M2相关细胞因子）基因表达显著升高，与B-Exo组效果相当。

这些结果表明，BC-Exo整合了B-Exo的抗炎优势和C-Exo的软骨保护功能，在体外炎症微环境中对CCs和BMDMs的调控效果优于单一外泌体。

 

4、外泌体负载HAMA微球（Exo-MS）的制备及体内抗OA效果评估

图4A：实验流程示意图，包括Exo-MS制备（i）、OA大鼠模型建立与给药方案（ii）、机械痛阈测试（iii）和步态分析（iv）。

图4B：明场显微镜显示，Exo-MS在油相中的形态完整。

图4C：共聚焦成像显示，DiI标记的B-Exo和DiO标记的C-Exo在微球内均匀分布，白色虚线为微球边界。

图4D：尺寸分布分析显示，Exo-MS平均直径为111±35μm。

图4E：体外释放曲线显示，Exo-MS呈现双相释放特征，前5天为快速释放期（释放超50%），随后进入缓慢缓释期，14天释放趋于平稳。

图4F：Von Frey测试显示，12周时BC-Exo-MS组大鼠后爪机械痛阈（26.54g）显著高于B-Exo-MS（14.27g）和C-Exo-MS（20.66g）组。

图4G：步态分析显示，BC-Exo-MS组大鼠步长更长、站立时间更短，关节活动功能改善更显著。

图4H：μCT成像显示，BC-Exo-MS组大鼠膝关节骨赘形成显著少于其他处理组。

图4I：膝关节宽度测量显示，BC-Exo-MS组关节肿胀程度显著轻于B-Exo-MS、C-Exo-MS组及对照组。

图4J：骨赘体积定量分析显示，BC-Exo-MS组骨赘体积显著小于B-Exo-MS和C-Exo-MS组。

图4K：ELISA显示，BC-Exo-MS组大鼠关节滑液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平显著低于C-Exo-MS组，与B-Exo-MS组相当。

这些结果表明，Exo-MS具有良好的形态特征和缓释性能，BC-Exo-MS在体内能显著缓解OA大鼠的疼痛、改善关节功能、抑制骨赘形成和炎症反应。

 

5、关节组织学变化分析

图5A：HE染色显示，BC-Exo-MS组关节软骨表面相对光滑、结构完整，损伤程度显著轻于其他处理组。

图5B：HE染色显示，PBS和MS组滑膜衬里层增厚、细胞密度增加，B-Exo-MS和BC-Exo-MS组滑膜炎症显著缓解。

图5C：番红O-固绿染色显示，BC-Exo-MS组软骨基质染色强度较高，OARSI评分显著低于其他处理组。

图5D：IHC染色显示，BC-Exo-MS组软骨组织中COL-Ⅱ表达强度显著高于B-Exo-MS组。

图5E：免疫荧光染色显示，BC-Exo-MS组软骨细胞中凋亡标志物Cleaved Caspase-3荧光强度显著低于B-Exo-MS组。

图5F：免疫荧光染色显示，BC-Exo-MS组滑膜中CD11b⁺CD86⁺（M1型）巨噬细胞数量显著减少。

图5G：免疫荧光染色显示，BC-Exo-MS组滑膜中CD11b⁺CD206⁺（M2型）巨噬细胞数量显著增加。

这些结果表明，BC-Exo-MS能有效减轻OA大鼠的滑膜炎症、保护软骨基质完整性、抑制软骨细胞凋亡，组织学改善效果优于单一外泌体处理。

 

6、BC-Exo缓解OA进展的分子机制探究

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图6A：大鼠膝关节软骨区域组织转录组分析流程示意图。

图6B：火山图显示，BC-Exo-MS组与MS组相比，共有272个基因上调、237个基因下调，涉及炎症调控和软骨修复相关基因。

图6C：GO富集分析显示，上调基因主要参与ECM合成、软骨稳态调控等过程，下调基因涉及金属肽酶表达、病理性血管生成等功能。

图6D：KEGG通路分析显示，BC-Exo-MS组富集了细胞因子-受体相互作用、ECM-受体相互作用等通路。

图6E：GSEA分析显示，BC-Exo-MS组在炎症反应、趋化因子受体结合等过程中显著富集。

图6F：Western blot显示，转染miR-7a-5p mimic后，BMDMs中NOTCH-3蛋白表达降低87.18%（i）。转染miR-708-5p mimic后，CCs中NRP-1蛋白表达降低46.57%（ii）。转染miR-431 mimic后，CCs中BRCA-1蛋白表达降低1.59倍（iii）。内参蛋白β-actin表达水平（iv）。

图6G：qRT-PCR显示，miR-7a-5p mimic转染后，BMDMs中iNOS和TNF-α基因表达分别降低97.87%和31.69%（i）。miR-708-5p mimic转染后，CCs中Col-Ⅱ和Acan基因表达升高超4倍，MMP-13基因表达降低超10倍（ii）。miR-431 mimic转染后，CCs中Plk-1和Bcl-2基因表达分别升高1.95倍和显著上调，Bax基因表达降低（iii）。

图6H：公共数据集（GSE114007、GSE117999）分析显示，人OA软骨中Notch-3、Nrp-1、Brca-1基因表达均显著高于正常软骨。

这些结果表明，BC-Exo通过B-Exo中的miR-7a-5p/NOTCH-3通路抑制炎症，通过C-Exo中的miR-708-5p/NRP-1通路促进软骨修复、miR-431/BRCA-1/PLK-1通路抑制软骨细胞凋亡，共同发挥抗OA作用。

 

结论

本研究明确了B-Exo和C-Exo在miRNA富集特征和生物学功能上的差异，提出并验证了双外泌体组合（BC-Exo）的协同治疗价值。通过微流控技术构建的BC-Exo负载HAMA微球，实现了外泌体的缓释递送和关节内长效滞留，且生物安全性良好。体内外实验证实，BC-Exo能整合B-Exo的抗炎优势（调控巨噬细胞M2极化）和C-Exo的软骨保护功能（促进ECM合成、抑制软骨细胞凋亡），通过miR-7a-5p/NOTCH-3、miR-708-5p/NRP-1及miR-431/BRCA-1/PLK-1三条核心通路，多靶点改善OA关节的炎症微环境和软骨退变，显著缓解疼痛、改善关节功能。该研究为OA的多靶点治疗提供了创新策略，也为外泌体组合疗法的临床转化奠定了基础。