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公司新闻/正文
CAFs释放的含microRNA-181d-5p的外泌体通过调节乳腺癌中CDX2\HOXA5促进EMT
1292 人阅读发布时间：2020-02-14 16:16
研究表明癌相关的成纤维细胞(CAF)可通过调节细胞外基质重塑和生长因子信号传导来调节肿瘤的转移，同时还具促EMT作用。2019年11月哈尔滨医科大学肿瘤医院的李志高教授在Molecular Therapy: Nucleic Acids杂志上发表的一篇文章探索了CAF对乳腺癌的作用，发现CAF通过释放携带miR-181d-5p的外泌体靶向CDX2和HOXA5以加速乳腺癌的进展。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6970169/
实验结果如下：
Figure 1. HOXA5在乳腺癌组织和细胞中低表达
2.过表达HOXA5抑制MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移和EMT，诱导细胞凋亡
在MCF-7细胞中干扰和过表达HOXA5的表达，以研究HOXA5对乳腺癌细胞增殖，侵袭，迁移，EMT和凋亡的影响。用过表达的HOXA5（oe-HOXA5）质粒转染的细胞能高表达HOXA5，sh-HOXA5转染的细胞能下调HOXA5表达（图2 A–2C）。EdU染色表明，oe-HOXA5可抑制细胞增殖（图2 D）。TUNEL染色表明oe-HOXA5促进MCF-7细胞的凋亡（图2E）。Transwell测定揭示了oe-HOXA5抑制MCF-7细胞侵袭（图2 F）。划痕实验亦证明了这一点（图2 G）。oe-HOXA5可增强E-cadherin和vimentin的表达，降低N-cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达（图2H和2I）。因此，HOXA5的过度表达可以促进癌细胞凋亡并抑制增殖，侵袭，迁移和EMT。
Figure 2. HOXA5过表达抑制癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，并诱导MCF-7细胞凋亡
3.转录因子CDX2结合HOXA5启动子促进HOXA5的表达
JASPAR预测出转录因子CDX2可能与HOXA5的启动子结合（图3 A）。ChIP验证CDX2可以与HOXA5启动子结合（图3 C）。qRT-PCR和Western blot分析在乳腺癌组织中CDX2的表达较低（图3B）。然而，HOXA5表达随CDX2的过表达而升高，随CDX2的沉默而降低（图3 D和3E）。因此，HOXA5表达受转录因子CDX2调控。CDX2的下调抑制HOXA5的表达，CDX2的上调则促进HOXA5的表达。
Figure 3. CDX2通过结合HOXA5启动子增强其表达
4.miR-181d-5p靶向CDX2
为了进一步研究CDX2如何在乳腺癌细胞中发挥作用，对与乳腺癌相关的基因表达数据集GSE59247进行差异分析，筛选出46个上调的miRNA和92个下调的miRNA。选择具有最低p值的前50个miRNA，以绘制差异表达的miRNA的热图（图4 A）。TargetScan预测出miR-181d-5p可靶向CDX2（图4 B）。前研究报告显示miR-181d-5p参与了乳腺癌的发生，提示miR-181d-5p可能调节乳腺癌中的CDX2。
根据TargetScan（图4A和4B）分析CDX2上miR-181d-5p的结合位点。双荧光素酶报告基因分析，在miR-181d-5p mimic的存在下，CDX2-WT的荧光素酶活性降低，而CDX2-MUT不变（图4 D）。此外，miR-181d-5p在乳腺癌组织中的表达增加（图4 C）。在MCF-7细胞中miR-181d-5p mimic可下调CDX2表达，而miR-181d-5p inhibitor提高了CDX2表达（图4E–4G）。上述发现进一步证明了CDX2的表达受到miR-181d-5p的调节。
Figure 4. CDX2是miR-181d-5p的靶基因
5.CAF释放的外泌体促MCF-7细胞增殖，抑制凋亡
RNA-FISH和IF确定miR-181d-5p在乳腺癌细胞和肿瘤基质中表达，且在肿瘤基质中高表达（图5A）。从乳腺癌组织和邻近的正常组织中分离出CAF和正常成纤维细胞（NFs），相对于NF，CAF特异性基因的表达包括FAP、FSP1、肌动蛋白α2、ACTA2和CD90在CAF中升高（图 5B ）。IF证实，NF和CAF均表达vimentin，只有CAF表达CAF的特异性标志物α-SMA（图5 C和5D），表明成功分离了CAF。同时发现，CAF中miR-181d-5p的表达高于NF中的表达（图5 F）。
用CAF或NF的培养基（CM）处理MCF-7细胞。CAF-CM促进MCF-7细胞增殖，而NF-CM对MCF-7细胞的增殖几乎没有影响（图5 G）。此外，通过检索EV miRNA数据库，发现成纤维细胞分泌的外泌体含有miR-181d-5p（图5E）。因此，推测携带miR-181d-5p的CAF外泌体可促进乳腺癌的进展。用GW4869抑制CAF产生外泌体，并用CAF-CM或NF-CM处理MCF-7细胞。进行EdU分析和TUNEL评估发现，相对于NF-CM，用CAF-CM处理后细胞增殖增加，细胞凋亡减少，这被GW4869的共处理所阻断（图5 H和5I）。因此，CAF的外泌体可促进乳腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡。
Figure 5. CAF释放的含miR-181d-5p的外泌体增强MCF-7细胞增殖，抑制凋亡
6.miR-181d-5p通过下调CDX2和HOXA5介导MCF-7细胞的增殖和凋亡
为研究CAF的外泌体对乳腺癌的作用，提取CAF的外泌体，TEM显示CAF的外泌体呈均匀的圆形或椭圆形膜状囊泡（图6 A）。NTA显示其直径范围为30 nm至120 nm（图6 B）。CD63和HSP70在外泌体中高表达（图6 C）。流式细胞仪检测外泌体表面标志物CD63（图6D）。表明成功提取出外泌体。将标记的外泌体与MCF-7细胞共培养48h，在共聚焦荧光显微镜下观察到MCF-7可摄取CAF的外泌体（图6 E）。
将MCF-7细胞与外泌体共培养。发现exo-miR-181d-5p mimic促 miR-181d-5p的表达但降低CDX2和HOXA5的表达，而exo-miR-181d-5p inhibitor导致相反的结果（图6 F-6H），含miR-181d-5p的CAF外泌体可以转移至乳腺癌细胞中，以调节CDX2和HOXA5的表达。体外实验表明，exo-miR-181d-5p mimic可增加MCF-7细胞增殖，促细胞侵袭和迁移能力，抑制凋亡，而exo-miR -181d-5p inhibitor致反向结果（图6I–6L）。同时，exo-miR-181d-5p mimic 降低E-cadherin 和vimentin的表达，而N-cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达升高（图6 M和6N）。因此，含miR-181d-5p的CAF外泌体可以通过调节CDX2和HOXA5来增强乳腺癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，抑制细胞凋亡。
Figure 6. CAF释放的含miR-181d-5p的外泌体通过抑制CDX2和HOXA5促进癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，并抑制乳腺癌细胞凋亡
7.CAF释放的含miR-181d-5p外泌体在体内通过靶向CDX2和HOXA5促乳腺癌的EMT
最后，为分析CAF的外泌体对体内乳腺癌生长和转移的影响，向裸鼠皮下注射MCF-7细胞以建立异种移植肿瘤模型。尾静脉注射过表达或沉默miR-181d-5p的外泌体。exo-miR-181d-5p mimic促肿瘤生长和增加的肿瘤重量和体积（图7A–7C）。TUNEL染色发现exo-miR-181d-5p mimic可减少细胞凋亡，而exo-miR-181d-5p inhibitor可促细胞凋亡（图7 D）。
IHC显示，exo-miR-181d-5p inhibitor可促CDX2和HOXA5的表达（图7E）。exo-miR-181d-5p mimic降低移植瘤中E-cadherin 和vimentin的表达，N- cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达增加（图 7F和7G）。总之，含有miR-181d-5p的CAF的外泌体可以通过调节CDX2和HOXA5促进乳腺癌细胞的EMT。
总结：
本文研究表明携带miR-181d-5p的CAF的外来体通过减少CDX2和HOXA5的表达，促进EMT，增殖，侵袭和迁移，并在乳腺癌细胞凋亡中起抑制作用。此发现提供了乳腺癌治疗的一个新途径，对携带miR-181d-5p的CAF外泌体的研究可更好地了解乳腺癌的治疗方法。
Figure 8. CAF释放的含miR-181d-5p通过靶向CDX2和HOXA5促进乳腺癌的EMT
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6970169/
实验结果如下：
- HOXA5在乳腺癌组织和细胞中低表达
Figure 1. HOXA5在乳腺癌组织和细胞中低表达
2.过表达HOXA5抑制MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移和EMT，诱导细胞凋亡
在MCF-7细胞中干扰和过表达HOXA5的表达，以研究HOXA5对乳腺癌细胞增殖，侵袭，迁移，EMT和凋亡的影响。用过表达的HOXA5（oe-HOXA5）质粒转染的细胞能高表达HOXA5，sh-HOXA5转染的细胞能下调HOXA5表达（图2 A–2C）。EdU染色表明，oe-HOXA5可抑制细胞增殖（图2 D）。TUNEL染色表明oe-HOXA5促进MCF-7细胞的凋亡（图2E）。Transwell测定揭示了oe-HOXA5抑制MCF-7细胞侵袭（图2 F）。划痕实验亦证明了这一点（图2 G）。oe-HOXA5可增强E-cadherin和vimentin的表达，降低N-cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达（图2H和2I）。因此，HOXA5的过度表达可以促进癌细胞凋亡并抑制增殖，侵袭，迁移和EMT。
Figure 2. HOXA5过表达抑制癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，并诱导MCF-7细胞凋亡
3.转录因子CDX2结合HOXA5启动子促进HOXA5的表达
JASPAR预测出转录因子CDX2可能与HOXA5的启动子结合（图3 A）。ChIP验证CDX2可以与HOXA5启动子结合（图3 C）。qRT-PCR和Western blot分析在乳腺癌组织中CDX2的表达较低（图3B）。然而，HOXA5表达随CDX2的过表达而升高，随CDX2的沉默而降低（图3 D和3E）。因此，HOXA5表达受转录因子CDX2调控。CDX2的下调抑制HOXA5的表达，CDX2的上调则促进HOXA5的表达。
Figure 3. CDX2通过结合HOXA5启动子增强其表达
4.miR-181d-5p靶向CDX2
为了进一步研究CDX2如何在乳腺癌细胞中发挥作用，对与乳腺癌相关的基因表达数据集GSE59247进行差异分析，筛选出46个上调的miRNA和92个下调的miRNA。选择具有最低p值的前50个miRNA，以绘制差异表达的miRNA的热图（图4 A）。TargetScan预测出miR-181d-5p可靶向CDX2（图4 B）。前研究报告显示miR-181d-5p参与了乳腺癌的发生，提示miR-181d-5p可能调节乳腺癌中的CDX2。
根据TargetScan（图4A和4B）分析CDX2上miR-181d-5p的结合位点。双荧光素酶报告基因分析，在miR-181d-5p mimic的存在下，CDX2-WT的荧光素酶活性降低，而CDX2-MUT不变（图4 D）。此外，miR-181d-5p在乳腺癌组织中的表达增加（图4 C）。在MCF-7细胞中miR-181d-5p mimic可下调CDX2表达，而miR-181d-5p inhibitor提高了CDX2表达（图4E–4G）。上述发现进一步证明了CDX2的表达受到miR-181d-5p的调节。
Figure 4. CDX2是miR-181d-5p的靶基因
5.CAF释放的外泌体促MCF-7细胞增殖，抑制凋亡
RNA-FISH和IF确定miR-181d-5p在乳腺癌细胞和肿瘤基质中表达，且在肿瘤基质中高表达（图5A）。从乳腺癌组织和邻近的正常组织中分离出CAF和正常成纤维细胞（NFs），相对于NF，CAF特异性基因的表达包括FAP、FSP1、肌动蛋白α2、ACTA2和CD90在CAF中升高（图 5B ）。IF证实，NF和CAF均表达vimentin，只有CAF表达CAF的特异性标志物α-SMA（图5 C和5D），表明成功分离了CAF。同时发现，CAF中miR-181d-5p的表达高于NF中的表达（图5 F）。
用CAF或NF的培养基（CM）处理MCF-7细胞。CAF-CM促进MCF-7细胞增殖，而NF-CM对MCF-7细胞的增殖几乎没有影响（图5 G）。此外，通过检索EV miRNA数据库，发现成纤维细胞分泌的外泌体含有miR-181d-5p（图5E）。因此，推测携带miR-181d-5p的CAF外泌体可促进乳腺癌的进展。用GW4869抑制CAF产生外泌体，并用CAF-CM或NF-CM处理MCF-7细胞。进行EdU分析和TUNEL评估发现，相对于NF-CM，用CAF-CM处理后细胞增殖增加，细胞凋亡减少，这被GW4869的共处理所阻断（图5 H和5I）。因此，CAF的外泌体可促进乳腺癌细胞的增殖并抑制其凋亡。
Figure 5. CAF释放的含miR-181d-5p的外泌体增强MCF-7细胞增殖，抑制凋亡
6.miR-181d-5p通过下调CDX2和HOXA5介导MCF-7细胞的增殖和凋亡
为研究CAF的外泌体对乳腺癌的作用，提取CAF的外泌体，TEM显示CAF的外泌体呈均匀的圆形或椭圆形膜状囊泡（图6 A）。NTA显示其直径范围为30 nm至120 nm（图6 B）。CD63和HSP70在外泌体中高表达（图6 C）。流式细胞仪检测外泌体表面标志物CD63（图6D）。表明成功提取出外泌体。将标记的外泌体与MCF-7细胞共培养48h，在共聚焦荧光显微镜下观察到MCF-7可摄取CAF的外泌体（图6 E）。
将MCF-7细胞与外泌体共培养。发现exo-miR-181d-5p mimic促 miR-181d-5p的表达但降低CDX2和HOXA5的表达，而exo-miR-181d-5p inhibitor导致相反的结果（图6 F-6H），含miR-181d-5p的CAF外泌体可以转移至乳腺癌细胞中，以调节CDX2和HOXA5的表达。体外实验表明，exo-miR-181d-5p mimic可增加MCF-7细胞增殖，促细胞侵袭和迁移能力，抑制凋亡，而exo-miR -181d-5p inhibitor致反向结果（图6I–6L）。同时，exo-miR-181d-5p mimic 降低E-cadherin 和vimentin的表达，而N-cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达升高（图6 M和6N）。因此，含miR-181d-5p的CAF外泌体可以通过调节CDX2和HOXA5来增强乳腺癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，抑制细胞凋亡。
Figure 6. CAF释放的含miR-181d-5p的外泌体通过抑制CDX2和HOXA5促进癌细胞增殖，侵袭，迁移和EMT，并抑制乳腺癌细胞凋亡
7.CAF释放的含miR-181d-5p外泌体在体内通过靶向CDX2和HOXA5促乳腺癌的EMT
最后，为分析CAF的外泌体对体内乳腺癌生长和转移的影响，向裸鼠皮下注射MCF-7细胞以建立异种移植肿瘤模型。尾静脉注射过表达或沉默miR-181d-5p的外泌体。exo-miR-181d-5p mimic促肿瘤生长和增加的肿瘤重量和体积（图7A–7C）。TUNEL染色发现exo-miR-181d-5p mimic可减少细胞凋亡，而exo-miR-181d-5p inhibitor可促细胞凋亡（图7 D）。
IHC显示，exo-miR-181d-5p inhibitor可促CDX2和HOXA5的表达（图7E）。exo-miR-181d-5p mimic降低移植瘤中E-cadherin 和vimentin的表达，N- cadherin，Slug，Snail1，Twist1，ZEB1和ZEB2的表达增加（图 7F和7G）。总之，含有miR-181d-5p的CAF的外泌体可以通过调节CDX2和HOXA5促进乳腺癌细胞的EMT。
总结：
本文研究表明携带miR-181d-5p的CAF的外来体通过减少CDX2和HOXA5的表达，促进EMT，增殖，侵袭和迁移，并在乳腺癌细胞凋亡中起抑制作用。此发现提供了乳腺癌治疗的一个新途径，对携带miR-181d-5p的CAF外泌体的研究可更好地了解乳腺癌的治疗方法。
Figure 8. CAF释放的含miR-181d-5p通过靶向CDX2和HOXA5促进乳腺癌的EMT