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公司新闻/正文
缺氧下MSC细胞分泌的携带miR-216a-5p外泌体可通过调控小胶质细胞M1/M2极化修复外伤性脊髓损伤
3894 人阅读发布时间：2020-02-17 11:23
脊髓损伤（SCI）可能导致严重的运动和感觉功能障碍，致残率和死亡率较高。近年来，间充质干细胞（MSC）分泌的外泌体已显示出促SCI后功能行为恢复的巨大潜力。然而，MSC通常在体外暴露于常氧，这与体内低氧微环境有很大的不同。因此，由南京医科大学第一医院骨科的刘伟在Journal of Neuroinflammation杂志上发表的一篇文章，确定了在小鼠SCI后，低氧MSC的外泌体（HExos）对SCI正常行为恢复表现出更大的作用，并探究了其潜在机制。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7001326/
研究结果：
1.骨髓间充质干细胞的鉴定
从小鼠体内分离的骨髓间充质干细胞（BMSC）形态呈纺锤状（图SA）。茜素红，奥利红O和阿尔辛蓝染色分别鉴定BMSC的成骨，成脂和成软骨分化（图S1B）。流式细胞仪分析确认了CD73和CD105呈阳性表达，但对CD34和CD45呈阴性（图S1C）。表明成功分离培养BMSC细胞。
Figure S1 骨髓间充质干细胞的鉴定
2.低氧促进BMSC细胞释放外泌体
使用TEM、NTA和Western blot对BMSCs在常氧和低氧（1％O 2）培养条件下分泌的外泌体进行分析鉴定（图 1A，B）。两组之间在大小，形状或电子密度方面均未观察到形态学差异。Western blot发现TSG101，CD9，CD63，CD81在低氧组中表达较常氧高（图1C）。此外，与常氧Exos相比，低氧组HExos的蛋白质浓度更高(图 1D）。表明低氧可诱导外泌体的释放。
Figure 1 低氧促进BMSC细胞释放外泌体
3.BV2细胞摄取外泌体的差异取决于氧
为了探究BV2细胞是否正常吸收了Exos和HExos，使用Dil标记外泌体，与BV2共培养24hrs。如图1E所示，与Exos相比，BV2细胞对摄取较多，图 1F表明两组之间在12hrs后有明显统计学差异显著，表明HExos更易被BV2细胞吸收。
4.与Exos相比HExos促进SCI后的功能行为恢复
为研究HExos是否能比Exos对SCI后的功能行为恢复更有益，使用BMS评估小鼠的功能行为恢复，如图 2A，HExos组和的小鼠比PBS组的小鼠表现出更好的功能改善，但HExos组效果更佳。与PBS组和Exos组小鼠相比，HExos组小鼠显示更快步态恢复和运动的协调（图 2B）。用Exos或HExos治疗后，脊髓病变面积明显小于PBS组（图 2C），且HExos组的病变面积明显小于Exos组。在SCI后第3天对小鼠进行MRI分析，与Exos组相比注射HExos显著减少病变区域（图 2C）。同时如图2E，与PBS组相比，Exos组的NeuN阳性神经元数量增加，HExos组的神经元数量明显多于Exos组。通过对神经丝（NF200）的200 kDa亚基进行免疫染色分析，损伤28天后与远区相比，HExos组病变区域NF200的染色减少（图2F）。为了进一步研究运动功能行为恢复，应用了电生理分析，如图2G，MEP振幅检测表明HExos组比Exos组显示出更高的电生理功能恢复。综上所述，Exos和HExos均可促进小鼠SCI后的功能行为恢复，但HExos治疗效果更为明显。
Figure 2 与Exos相比HExos促进SCI后的功能行为恢复
5.HExos给药促进体内小胶质细胞/巨噬细胞极化从M1变为M2表型
ELISA测定不同组脊髓中促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的浓度以及抗炎细胞因子（TGF-β，IL-4和IL-10）的浓度，结果显示，与PBS组相比，用Exos和HExos可以降低促炎细胞因子的浓度并提高抗炎细胞因子的浓度。但是，与Exos相比，HExos作用更加显著（图 3A）。如图3B，与PBS组相比，Exos组和HExos组M2基因（Arg1，CD206，YM1 / 2）表达增加，M1基因（iNOS，TNF-α，IL-1β）的表达减少。与Exos组相比，HExos组的M2基因表达较高，而M1表达较低。Western blot也证实了此结果（图3C）。 此外，对iNOS、Arg1和Iba1进行双免疫荧光染色，评估了SCI后不同组中小胶质细胞/巨噬细胞的极化特性，如图3D-F，三组中Iba1阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量没有显着差异，但在病变处观察到iNOS阳性小胶质细胞显着减少，而Arg1阳性小胶质细胞/巨噬细胞较多。与Exos组相比，HExos组中iNOS阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量趋于减少，而Arg1阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量增加。因此，HExos对SCI后抗炎表型与促炎表型的比率具有显着影响，并且可能使小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2。
Figure 3 SCI后HExos处理可促进小鼠体内小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2
6.HExos 在体外促BV2细胞和PM细胞从M1极化为M2
LPS处理BV2细胞和原代胶质细胞（PM）24hrs，以模拟SCI环境，再加入PBS，Exos或HExos之前处理，48hrs后，发现Exos和HExos均可抑制TNF-α, IL-1β和 IL-6浓度并促进TGF-β, IL-4和IL-10分泌（图 4A,C）。且HExos发挥了更大的作用。同时Exos和HExos可降低M1标志基因的表达并增加M2标志基因的表达，且HExos作用更显著，这与体内结果相似（图 4B-F）。iNOS和Arg1的表达水平亦受HExos的影响（图4G,H）。因此，在体外，HExos可将BV2和PM细胞极化为M2。
Figure 3 SCI后HExos处理可促进小鼠体内小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2
6.HExos 在体外促BV2细胞和PM细胞从M1极化为M2
LPS处理BV2细胞和原代胶质细胞（PM）24hrs，以模拟SCI环境，再加入PBS，Exos或HExos之前处理，48hrs后，发现Exos和HExos均可抑制TNF-α, IL-1β和 IL-6浓度并促进TGF-β, IL-4和IL-10分泌（图 4A,C）。且HExos发挥了更大的作用。同时Exos和HExos可降低M1标志基因的表达并增加M2标志基因的表达，且HExos作用更显著，这与体内结果相似（图 4B-F）。iNOS和Arg1的表达水平亦受HExos的影响（图4G,H）。因此，在体外，HExos可将BV2和PM细胞极化为M2。
Figure 5 miR-216a-5p在HExos中上调，并通过外泌体转移到BV2和PM细胞中
8.在体内HEXos通过miR-216a-5p促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转为M2型
如图6A,C，miR OE -HExos的使用可下调SCI小鼠脊髓组织中的促炎细胞因子，上调脊髓组织中的抑炎细胞因子。miROE -HExos促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转M2型，而miR KD -HExos的使用得到相反的结果（图6B-F）。同时，IF结果证实此结果（图6G）。
Figure 6 在体内HEXos通过miR-216a-5p促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转为M2型
9.HEXos通过miR-216a-5p促进BV2和PM细胞极化从M1型转为M2型
miR-NC OE -HExos和miR OE -HExos处理BV2细胞，并将miR-NC KD -HExos和miR KD -HExos处理PM细胞。miR OE -HExos组的促炎细胞因子减少而抗炎细胞因子增加（图 7A）。miROE-HExos将BV2细胞极化为M2型（图 7B,D,E,F,G,H），表明，在体外HExos通过miR-216a-5p促BV2和PM细胞极化从M1转为M2。
Figure 7 HEXos通过miR-216a-5p促进BV2和PM细胞极化从M1型转为M2型
10.miR-216a-5p通过靶向3'-UTR来调节TLR4
根据miRNA靶标的在线数据库分析发现TLR4可能是miR-216a-5p的靶基因。构建了TLR4的野生型（WT）和突变型（MUT）3'-UTR序列（图 8A）。miR-216a-5p和WT-3'UTR共转染到BV2和PM细胞中时，可降低萤光素酶的活性（图 8B）。miR-216A-5P过表达后，RNA-ChIP分析出TLR4 mRNA富集于Ago2/ RISC（图8C）。在miR-216a-5p过表达的细胞中观察到了掺入RISC的TLR4水平的富集。此外，miR-216A-5P过表达降低TLR4 mRNA和蛋白水平，miR-216A-5P的下调增加了TLR4 mRNA和蛋白表达水平（图8D-E），其进一步证实TLR4是miR-216a-5p的下游靶基因。
Figure 8 miR-216a-5p通过靶向3'-UTR来调节TLR4
11.外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4调节小胶质细胞M1/M2极化
为了验证外泌体miR-216a-5p对调节小胶质细胞表型转变是通过调节TLR4介导的，如图 9A,C，TLR4的过表达促进促炎细胞因子的释放并抑制抗炎细胞因子的释放，而TLR4的敲低显示相反的作用。TLR4过表达能有效逆转miROE-HExos的作用，促进M2向M1极化（图 9B-H)。表明外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4来调节小胶质细胞M1 / M2极化。
Figure 9 外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4调节小胶质细胞M1/M2极化
12.外泌体miR-216a-5p通过TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应调节小胶质细胞M1 / M2极化
miROE-HExos 处理BV2细胞后，TLR4、p-P65、MyD88和iNOS的蛋白质水平显著下调和p-PI3K，p-AKT，和Arg1的蛋白质水平受到上调（图 10A）。同时，miRKD-HExos处理PM细胞后，TLR4、p-P65、MyD88和iNOS的表达水平上调和p-PI3K、p-AKT和Arg1的表达水平下调（图 10B）。这些研究表明，外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应而参与了HExos介导的小胶质细胞极化。
Figure 10 外泌体miR-216a-5p通过TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应调节小胶质细胞M1 / M2极化
总之，作者发现来自缺氧MSC的外泌体通过miR-216a-5p能促进小鼠SCI后的功能行为恢复，miR-216a-5p靶向TLR4抑制TLR4/NF-KB激活PI3K/AKT信号通路，从而诱导小胶质细胞M1 / M2极化。缺氧预处理优化了MSC外泌体的治疗效果，这是一种有前景的方法，而miRNA和MSC来源的外泌体的组合可能是一种有价值的微创治疗SCI的方法。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7001326/
研究结果：
1.骨髓间充质干细胞的鉴定
从小鼠体内分离的骨髓间充质干细胞（BMSC）形态呈纺锤状（图SA）。茜素红，奥利红O和阿尔辛蓝染色分别鉴定BMSC的成骨，成脂和成软骨分化（图S1B）。流式细胞仪分析确认了CD73和CD105呈阳性表达，但对CD34和CD45呈阴性（图S1C）。表明成功分离培养BMSC细胞。
Figure S1 骨髓间充质干细胞的鉴定
2.低氧促进BMSC细胞释放外泌体
使用TEM、NTA和Western blot对BMSCs在常氧和低氧（1％O 2）培养条件下分泌的外泌体进行分析鉴定（图 1A，B）。两组之间在大小，形状或电子密度方面均未观察到形态学差异。Western blot发现TSG101，CD9，CD63，CD81在低氧组中表达较常氧高（图1C）。此外，与常氧Exos相比，低氧组HExos的蛋白质浓度更高(图 1D）。表明低氧可诱导外泌体的释放。
Figure 1 低氧促进BMSC细胞释放外泌体
3.BV2细胞摄取外泌体的差异取决于氧
为了探究BV2细胞是否正常吸收了Exos和HExos，使用Dil标记外泌体，与BV2共培养24hrs。如图1E所示，与Exos相比，BV2细胞对摄取较多，图 1F表明两组之间在12hrs后有明显统计学差异显著，表明HExos更易被BV2细胞吸收。
4.与Exos相比HExos促进SCI后的功能行为恢复
为研究HExos是否能比Exos对SCI后的功能行为恢复更有益，使用BMS评估小鼠的功能行为恢复，如图 2A，HExos组和的小鼠比PBS组的小鼠表现出更好的功能改善，但HExos组效果更佳。与PBS组和Exos组小鼠相比，HExos组小鼠显示更快步态恢复和运动的协调（图 2B）。用Exos或HExos治疗后，脊髓病变面积明显小于PBS组（图 2C），且HExos组的病变面积明显小于Exos组。在SCI后第3天对小鼠进行MRI分析，与Exos组相比注射HExos显著减少病变区域（图 2C）。同时如图2E，与PBS组相比，Exos组的NeuN阳性神经元数量增加，HExos组的神经元数量明显多于Exos组。通过对神经丝（NF200）的200 kDa亚基进行免疫染色分析，损伤28天后与远区相比，HExos组病变区域NF200的染色减少（图2F）。为了进一步研究运动功能行为恢复，应用了电生理分析，如图2G，MEP振幅检测表明HExos组比Exos组显示出更高的电生理功能恢复。综上所述，Exos和HExos均可促进小鼠SCI后的功能行为恢复，但HExos治疗效果更为明显。
Figure 2 与Exos相比HExos促进SCI后的功能行为恢复
5.HExos给药促进体内小胶质细胞/巨噬细胞极化从M1变为M2表型
ELISA测定不同组脊髓中促炎细胞因子（TNF-α，IL-1β和IL-6）的浓度以及抗炎细胞因子（TGF-β，IL-4和IL-10）的浓度，结果显示，与PBS组相比，用Exos和HExos可以降低促炎细胞因子的浓度并提高抗炎细胞因子的浓度。但是，与Exos相比，HExos作用更加显著（图 3A）。如图3B，与PBS组相比，Exos组和HExos组M2基因（Arg1，CD206，YM1 / 2）表达增加，M1基因（iNOS，TNF-α，IL-1β）的表达减少。与Exos组相比，HExos组的M2基因表达较高，而M1表达较低。Western blot也证实了此结果（图3C）。 此外，对iNOS、Arg1和Iba1进行双免疫荧光染色，评估了SCI后不同组中小胶质细胞/巨噬细胞的极化特性，如图3D-F，三组中Iba1阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量没有显着差异，但在病变处观察到iNOS阳性小胶质细胞显着减少，而Arg1阳性小胶质细胞/巨噬细胞较多。与Exos组相比，HExos组中iNOS阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量趋于减少，而Arg1阳性小胶质细胞/巨噬细胞的数量增加。因此，HExos对SCI后抗炎表型与促炎表型的比率具有显着影响，并且可能使小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2。
Figure 3 SCI后HExos处理可促进小鼠体内小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2
6.HExos 在体外促BV2细胞和PM细胞从M1极化为M2
LPS处理BV2细胞和原代胶质细胞（PM）24hrs，以模拟SCI环境，再加入PBS，Exos或HExos之前处理，48hrs后，发现Exos和HExos均可抑制TNF-α, IL-1β和 IL-6浓度并促进TGF-β, IL-4和IL-10分泌（图 4A,C）。且HExos发挥了更大的作用。同时Exos和HExos可降低M1标志基因的表达并增加M2标志基因的表达，且HExos作用更显著，这与体内结果相似（图 4B-F）。iNOS和Arg1的表达水平亦受HExos的影响（图4G,H）。因此，在体外，HExos可将BV2和PM细胞极化为M2。
Figure 3 SCI后HExos处理可促进小鼠体内小胶质细胞/巨噬细胞从M1极化为M2
6.HExos 在体外促BV2细胞和PM细胞从M1极化为M2
LPS处理BV2细胞和原代胶质细胞（PM）24hrs，以模拟SCI环境，再加入PBS，Exos或HExos之前处理，48hrs后，发现Exos和HExos均可抑制TNF-α, IL-1β和 IL-6浓度并促进TGF-β, IL-4和IL-10分泌（图 4A,C）。且HExos发挥了更大的作用。同时Exos和HExos可降低M1标志基因的表达并增加M2标志基因的表达，且HExos作用更显著，这与体内结果相似（图 4B-F）。iNOS和Arg1的表达水平亦受HExos的影响（图4G,H）。因此，在体外，HExos可将BV2和PM细胞极化为M2。
Figure 5 miR-216a-5p在HExos中上调，并通过外泌体转移到BV2和PM细胞中
8.在体内HEXos通过miR-216a-5p促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转为M2型
如图6A,C，miR OE -HExos的使用可下调SCI小鼠脊髓组织中的促炎细胞因子，上调脊髓组织中的抑炎细胞因子。miROE -HExos促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转M2型，而miR KD -HExos的使用得到相反的结果（图6B-F）。同时，IF结果证实此结果（图6G）。
Figure 6 在体内HEXos通过miR-216a-5p促进小胶质细胞/巨噬细胞从M1型转为M2型
9.HEXos通过miR-216a-5p促进BV2和PM细胞极化从M1型转为M2型
miR-NC OE -HExos和miR OE -HExos处理BV2细胞，并将miR-NC KD -HExos和miR KD -HExos处理PM细胞。miR OE -HExos组的促炎细胞因子减少而抗炎细胞因子增加（图 7A）。miROE-HExos将BV2细胞极化为M2型（图 7B,D,E,F,G,H），表明，在体外HExos通过miR-216a-5p促BV2和PM细胞极化从M1转为M2。
Figure 7 HEXos通过miR-216a-5p促进BV2和PM细胞极化从M1型转为M2型
10.miR-216a-5p通过靶向3'-UTR来调节TLR4
根据miRNA靶标的在线数据库分析发现TLR4可能是miR-216a-5p的靶基因。构建了TLR4的野生型（WT）和突变型（MUT）3'-UTR序列（图 8A）。miR-216a-5p和WT-3'UTR共转染到BV2和PM细胞中时，可降低萤光素酶的活性（图 8B）。miR-216A-5P过表达后，RNA-ChIP分析出TLR4 mRNA富集于Ago2/ RISC（图8C）。在miR-216a-5p过表达的细胞中观察到了掺入RISC的TLR4水平的富集。此外，miR-216A-5P过表达降低TLR4 mRNA和蛋白水平，miR-216A-5P的下调增加了TLR4 mRNA和蛋白表达水平（图8D-E），其进一步证实TLR4是miR-216a-5p的下游靶基因。
Figure 8 miR-216a-5p通过靶向3'-UTR来调节TLR4
11.外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4调节小胶质细胞M1/M2极化
为了验证外泌体miR-216a-5p对调节小胶质细胞表型转变是通过调节TLR4介导的，如图 9A,C，TLR4的过表达促进促炎细胞因子的释放并抑制抗炎细胞因子的释放，而TLR4的敲低显示相反的作用。TLR4过表达能有效逆转miROE-HExos的作用，促进M2向M1极化（图 9B-H)。表明外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4来调节小胶质细胞M1 / M2极化。
Figure 9 外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4调节小胶质细胞M1/M2极化
12.外泌体miR-216a-5p通过TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应调节小胶质细胞M1 / M2极化
miROE-HExos 处理BV2细胞后，TLR4、p-P65、MyD88和iNOS的蛋白质水平显著下调和p-PI3K，p-AKT，和Arg1的蛋白质水平受到上调（图 10A）。同时，miRKD-HExos处理PM细胞后，TLR4、p-P65、MyD88和iNOS的表达水平上调和p-PI3K、p-AKT和Arg1的表达水平下调（图 10B）。这些研究表明，外泌体miR-216a-5p通过靶向TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应而参与了HExos介导的小胶质细胞极化。
Figure 10 外泌体miR-216a-5p通过TLR4 /NF-κB/ PI3K / AKT信号级联反应调节小胶质细胞M1 / M2极化
总之，作者发现来自缺氧MSC的外泌体通过miR-216a-5p能促进小鼠SCI后的功能行为恢复，miR-216a-5p靶向TLR4抑制TLR4/NF-KB激活PI3K/AKT信号通路，从而诱导小胶质细胞M1 / M2极化。缺氧预处理优化了MSC外泌体的治疗效果，这是一种有前景的方法，而miRNA和MSC来源的外泌体的组合可能是一种有价值的微创治疗SCI的方法。