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研载生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
功能性外泌体介导的阿霉素和疏水修饰的microRNA 159共递送，可用于三阴性乳腺癌治疗
1390 人阅读发布时间：2020-02-24 14:54
目前有大量数据表明外泌体可作为内源性载体，输送治疗药物，但其不能靶向特定细胞的问题限制了其功能的发挥，由第二军医大学长海医院和上海交大九院联合做的一项研究，于2019年9月发表在J Nanobiotechnology杂志上，该研究表明使用含有A15蛋白（能特异性结合整合素αveβ3）的Exo，装载Dox和Cho-miRNA159后，在体内外具有治疗三阴性乳腺癌的作用。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6721253/
技术路线：
研究结果：
1.Exo复合物的表征
PMA（50ng/ml）处理THP-1细胞后再培养2-3天，细胞可释放富含A15的Exo，此Exo可依据A15上的RGD基序结合整合素αvβ3（在BC细胞上高表达）。超离提取未用和用PMA处理的THP-1细胞上清液中的Exo，通过TEM、NTA和Western blot给予鉴定（图1A-C）；且发现相同THP-1细胞数量存在时，PMA处理组分泌的Exo浓度高些（图1D）。
图 1 Dox和Cho-miR159装载的A15-Exo的表征
2.Dox和Cho-miRNA159的装载和释放
Exo装载Dox或Cho-miRNA(胆固醇修饰)后对外泌体的整体形态影响不大（图1A），但A15-Exo/Cho-miR159的zeta电位有所下降，可能是由于Cho-miR154带负电荷（图1E）引起的。Dox载入A15-Exo中的量取决于孵育时Dox的使用浓度，如图1F 所示，1ug A15-Exo与200ug/ml Dox孵育时表现出最大的装载量（160ng）。
37℃ pH为5.0（晚期胞内体和溶酶体环境）时，Co-A15-Exo（Dox和Cho-miR159均装载的A15-Exo）释放的Dox达到90.5％，而pH 7.4（生理环境）时仅55.3％（图1G）。表明Dox的释放具备pH依赖性。
如图1H所示，将Cho-miRNA装载到A15-Exo中的效率与miRNA浓度密切相关，在miRNA浓度为4nmol/mL时，miR159装载到A15-Exo中的效率约为1.2％，而Cho-miR159装载的效率为5.33％。同时作者使用IF证明Dox和Cy5-Cho-miRNA可被装载到Exo中；Cy5-Cho-miRNA组的荧光比Cy5-miRNA组强，说明胆固醇修饰利于Cy5-miRNA进入Exo内（图1I）。
3.A15-Exo的体外靶向性
从图S1可用看出，A15-Exo被MDA-MB-231摄入量多于其他组，而α v β 3表达低的MCF-7摄取Exo/A15-Exo量很少。且与Exo相比，在A15-Exo组观察到荧光信号在细胞表面聚集。另外FCM分析发现A15-Exo比Exo更有效地与MDA-MB-231细胞和B16细胞结合（图2A-C）。表明采用A15作为配体结合表达整合素α vβ 3细胞，提高了外泌体的靶向作用。
图2 Exo或A15-Exo介导的Dox和Cy5-Cho-miR159的内化
图 S1 MDA-MB-231和MCF-7摄取PKH67标记的Exo/A15-Exo情况
4.Cho-miRNA159和Dox被细胞摄取
如图2B,C所示，通过FCM分析发现MDA-MB-231细胞内化35.48±1.72％的A15-Exo / Dox和99.55±0.18％的A15-Exo / Cy5-Cho-miRNA；在B16细胞中76.43±3.92％A15-Exo / Dox和99.53±0.67％的A15-Exo / Cy5-Cho-miRNA。说明通过A15-Exo递送，细胞可以有效内化Dox和Cho-miRNA159。另IF表明，MDA-MB-231和B16细胞可通过摄取A15-Exo，获得其携带的Dox和Cy5-Cho-miRNA159（图3A,B）。
图 3 PKH67标记的载药Exo或A15-Exo被MDA-MB-231和B16细胞摄取的IF图
5.在体外载药Exo或A15-Exo对三阴性乳腺癌的治疗效果
CCK8分析培养基、Exo、Cho-miR159、Dox、A15-Exo、A15-Exo / Cho-miR159，A15-Exo / Dox和Co-A15-Exo对MDA-MB-231细胞活力的影响，发现与其他组相比，Co-A15-Exo能显著抑制细胞存活（图4A）。与Dox治疗组相比，在A15-Exo / Dox治疗组中检测到细胞凋亡增加，Cho-miR159组和A15-Exo / Cho-miR159组也分别显示了约28.26％和47.15％的凋亡, 但Co-A15-Exo组效果最佳（图4B）。
基于TCF7是miR-159的靶基因，通过qRT-PCR分析，Co-A15-Exo显著下调细胞中TCF7的表达，并逆转Dox对细胞中TCF7的上调作用（图4C）。并通过Western blot分析TCF7和MYC在蛋白质水平均在miR-159存在下被下调（图4D）。表明A15-Exo携带的Dox和Cho-miR159能在体外发挥抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖存活作用。
图4 Co-A15-Exo的体外抗肿瘤效果
6.体内实验分析Co-A15-Exo抑制肿瘤的功能
在小鼠体内建立异种移植瘤后，给与Cy5-Cho-miRNA、Exo-Cy5-Cho-miRNA或A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA处理，发现A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA处理组的肿瘤区域有大量荧光，而另外两组的荧光信号主要在肝脏和肾脏中（图5A）。表明A15-Exo将携带的miRNA靶向性递送至肿瘤组织中。
另，如图5B-E所示，与其他组相比，肿瘤的体积和重量在Co-A15-Exo处理下明显减少，且对小鼠的毒性较小，增加了小鼠的存活率。
HE实验分析发现游离Dox会引起心肌损伤，但通过使用A15-Exo携带Dox处理可显著减低Dox的心脏毒性（图6A）。同时肿瘤组织在Co-A15-Exo治疗后坏死更明显；Exo和miR159处理后瘤中CD31高表达，而Co-A15-Exo处理组显著降低了CD31的水平（图6B）；Ki67阳性细胞在Co-A15-Exo处理组也明显低于其他组。同时Co-A15-Exo处理组的肿瘤中TCF7和MYC的表达亦受到下调。表明Co-A15-Exo对肿瘤细胞增殖有抑制作用，抑制肿瘤的血管形成，促进肿瘤细胞坏死。
图 5 Co-A15-Exo在体内的生物分布和抗肿瘤效果
图 6 免疫组化分析
总结：
本文作者通过孵育的方式将Dox和Cho-miRNA共装载到富含A15蛋白的Exo中，并通过一系列实验确认载有化疗药物Dox和Cho-miRNA的A15-Exo具有更好的靶向和治疗三阴性乳腺癌的作用，此研究为促进天然纳米治疗药物的研发提供了支持。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6721253/
技术路线：
研究结果：
1.Exo复合物的表征
PMA（50ng/ml）处理THP-1细胞后再培养2-3天，细胞可释放富含A15的Exo，此Exo可依据A15上的RGD基序结合整合素αvβ3（在BC细胞上高表达）。超离提取未用和用PMA处理的THP-1细胞上清液中的Exo，通过TEM、NTA和Western blot给予鉴定（图1A-C）；且发现相同THP-1细胞数量存在时，PMA处理组分泌的Exo浓度高些（图1D）。
图 1 Dox和Cho-miR159装载的A15-Exo的表征
2.Dox和Cho-miRNA159的装载和释放
Exo装载Dox或Cho-miRNA(胆固醇修饰)后对外泌体的整体形态影响不大（图1A），但A15-Exo/Cho-miR159的zeta电位有所下降，可能是由于Cho-miR154带负电荷（图1E）引起的。Dox载入A15-Exo中的量取决于孵育时Dox的使用浓度，如图1F 所示，1ug A15-Exo与200ug/ml Dox孵育时表现出最大的装载量（160ng）。
37℃ pH为5.0（晚期胞内体和溶酶体环境）时，Co-A15-Exo（Dox和Cho-miR159均装载的A15-Exo）释放的Dox达到90.5％，而pH 7.4（生理环境）时仅55.3％（图1G）。表明Dox的释放具备pH依赖性。
如图1H所示，将Cho-miRNA装载到A15-Exo中的效率与miRNA浓度密切相关，在miRNA浓度为4nmol/mL时，miR159装载到A15-Exo中的效率约为1.2％，而Cho-miR159装载的效率为5.33％。同时作者使用IF证明Dox和Cy5-Cho-miRNA可被装载到Exo中；Cy5-Cho-miRNA组的荧光比Cy5-miRNA组强，说明胆固醇修饰利于Cy5-miRNA进入Exo内（图1I）。
3.A15-Exo的体外靶向性
从图S1可用看出，A15-Exo被MDA-MB-231摄入量多于其他组，而α v β 3表达低的MCF-7摄取Exo/A15-Exo量很少。且与Exo相比，在A15-Exo组观察到荧光信号在细胞表面聚集。另外FCM分析发现A15-Exo比Exo更有效地与MDA-MB-231细胞和B16细胞结合（图2A-C）。表明采用A15作为配体结合表达整合素α vβ 3细胞，提高了外泌体的靶向作用。
图2 Exo或A15-Exo介导的Dox和Cy5-Cho-miR159的内化
图 S1 MDA-MB-231和MCF-7摄取PKH67标记的Exo/A15-Exo情况
4.Cho-miRNA159和Dox被细胞摄取
如图2B,C所示，通过FCM分析发现MDA-MB-231细胞内化35.48±1.72％的A15-Exo / Dox和99.55±0.18％的A15-Exo / Cy5-Cho-miRNA；在B16细胞中76.43±3.92％A15-Exo / Dox和99.53±0.67％的A15-Exo / Cy5-Cho-miRNA。说明通过A15-Exo递送，细胞可以有效内化Dox和Cho-miRNA159。另IF表明，MDA-MB-231和B16细胞可通过摄取A15-Exo，获得其携带的Dox和Cy5-Cho-miRNA159（图3A,B）。
图 3 PKH67标记的载药Exo或A15-Exo被MDA-MB-231和B16细胞摄取的IF图
5.在体外载药Exo或A15-Exo对三阴性乳腺癌的治疗效果
CCK8分析培养基、Exo、Cho-miR159、Dox、A15-Exo、A15-Exo / Cho-miR159，A15-Exo / Dox和Co-A15-Exo对MDA-MB-231细胞活力的影响，发现与其他组相比，Co-A15-Exo能显著抑制细胞存活（图4A）。与Dox治疗组相比，在A15-Exo / Dox治疗组中检测到细胞凋亡增加，Cho-miR159组和A15-Exo / Cho-miR159组也分别显示了约28.26％和47.15％的凋亡, 但Co-A15-Exo组效果最佳（图4B）。
基于TCF7是miR-159的靶基因，通过qRT-PCR分析，Co-A15-Exo显著下调细胞中TCF7的表达，并逆转Dox对细胞中TCF7的上调作用（图4C）。并通过Western blot分析TCF7和MYC在蛋白质水平均在miR-159存在下被下调（图4D）。表明A15-Exo携带的Dox和Cho-miR159能在体外发挥抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖存活作用。
图4 Co-A15-Exo的体外抗肿瘤效果
6.体内实验分析Co-A15-Exo抑制肿瘤的功能
在小鼠体内建立异种移植瘤后，给与Cy5-Cho-miRNA、Exo-Cy5-Cho-miRNA或A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA处理，发现A15-Exo-Cy5-Cho-miRNA处理组的肿瘤区域有大量荧光，而另外两组的荧光信号主要在肝脏和肾脏中（图5A）。表明A15-Exo将携带的miRNA靶向性递送至肿瘤组织中。
另，如图5B-E所示，与其他组相比，肿瘤的体积和重量在Co-A15-Exo处理下明显减少，且对小鼠的毒性较小，增加了小鼠的存活率。
HE实验分析发现游离Dox会引起心肌损伤，但通过使用A15-Exo携带Dox处理可显著减低Dox的心脏毒性（图6A）。同时肿瘤组织在Co-A15-Exo治疗后坏死更明显；Exo和miR159处理后瘤中CD31高表达，而Co-A15-Exo处理组显著降低了CD31的水平（图6B）；Ki67阳性细胞在Co-A15-Exo处理组也明显低于其他组。同时Co-A15-Exo处理组的肿瘤中TCF7和MYC的表达亦受到下调。表明Co-A15-Exo对肿瘤细胞增殖有抑制作用，抑制肿瘤的血管形成，促进肿瘤细胞坏死。
图 5 Co-A15-Exo在体内的生物分布和抗肿瘤效果
图 6 免疫组化分析
总结：
本文作者通过孵育的方式将Dox和Cho-miRNA共装载到富含A15蛋白的Exo中，并通过一系列实验确认载有化疗药物Dox和Cho-miRNA的A15-Exo具有更好的靶向和治疗三阴性乳腺癌的作用，此研究为促进天然纳米治疗药物的研发提供了支持。