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公司新闻/正文
IRE1A刺激肝细胞来源的细胞外囊泡，促进脂肪性肝炎的小鼠炎症
1026 人阅读发布时间：2021-05-31 09:56
【关键词】内质网应激、外泌体、脂质毒性、巨噬细胞
【摘要】内质网至细胞核信号传导1（IRE1A）蛋白在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的肝脏中被激活，IRE1A激活后，干细胞释放富含神经酰胺的炎性细胞外囊泡（EVs），因此本文研究抑制IRE1A对饮食诱发的脂肪性肝炎小鼠炎性EVs释放的影响。构建模型鼠后，富强内注射IRE1A抑制剂或腺病毒转染小鼠肝脏和原代干细胞，收集后分离EVs进行检测。肝细胞中Ire1a破坏后EVs释放减少，肝损伤、炎症、巨噬细胞局部积累减少。IRE1A靶向编码神经酰胺合成限速酶，导致神经酰胺的生物合成和释放，从而影响EVs的分泌，导致脂肪性肝炎的小鼠肝脏受损。
【前言】非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）特征是肝细胞损伤，被认为是气球样变形和炎症，伴有纤维化，目前缺乏有效的治疗药物。NASH是众多信号通路之间相互作用的结果，包括遗传易感性、肠道营养不良、饮食摄入和脂质代谢异常，进而导致脂质毒性和炎症反应。内质网应激是脂毒性亚致死应激的重要表现，多项研究表明IRE1A-XBP1信号传导与NAFLD的胰岛素抵抗，血脂异常，肝脂肪变性，炎症相关。先前研究中，IRE1A对于从细胞中释放EVs是必须的，而EVs作为介导细胞间相互作用是必须的。目前IRE1A刺激的EVs在NASH中的作用仍然有待研究。
【结果】
NASH中存在脂毒性ER应激反应的激活。构建NASH小鼠模型，用IRE1A抑制剂处理模型鼠后检测Xbp1表达，组织学评估肝脏损伤，IHC和流式检测巨噬细胞浸润，检测巨噬细胞相关mRNA以及释放的因子，TUNEL检测肝细胞凋亡，检测肝脏纤维化相关指标。结果表明：IRE1A抑制剂可减少巨噬细胞浸润，减少肝脏损伤。
构建Ire1a基因敲除鼠，重复上述步骤，检测Xbp1的mRNA，EVs数量，肝功能，巨噬细胞浸润，肝脏纤维化等指标。
IRE1A抑制后循环EVs的数量也相应减少，表明IRE1A可调控肝细胞释放EVs。小鼠注射过表达IRE1A的腺病毒，检测EVs的数量和Xbp1的mRNA表达量，IRE1A抑制剂、IRE1A的RNase做rescue实验验证。对EVs进行表征，检测不同处理状态下的数量。
IRE1A可促进巨噬细胞的募集，诱导肝损伤。腺病毒转染的过表达IRE1A小鼠中IHC和流式分别检测巨噬细胞浸润，检测巨噬细胞相关mRNA和细胞因子表达，进一步流式检测分析髓样细胞来源的巨噬细胞亚型。结果表明：IRE1A可促进促炎型巨噬细胞浸润至肝脏。
IRE1A刺激原代小鼠肝细胞并分离EVs后尾静脉注射进小鼠体内，检测EVs的数量和肝脏对EVs的摄取情况，巨噬细胞浸润情况。结果表明：IRE1A肝细胞来源的EVs可促进巨噬细胞浸润至肝脏，并且展现出促炎表型。
探究IRE1A对EVs释放的调控机制。之前的研究中，脂毒性EVs的释放取决于神经酰胺的从头合成，因此研究IRE1A对神经酰胺从头合成途径的影响。
SPT催化神经酰胺合成的限速酶，因此ChIP实验从转录水平研究IRE1A对SPT的调节。SPT抑制剂抑制神经酰胺合成后检测EVs的数量进一步验证：神经酰胺合成途径对于EVs释放是重要的，而IRE1A可调节神经酰胺合成来调节EVs的合成。
在人类肝脏样本中验证XBP1和SPTLC1与炎症、EVs的数量之间的相关性。
【摘要】内质网至细胞核信号传导1（IRE1A）蛋白在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的肝脏中被激活，IRE1A激活后，干细胞释放富含神经酰胺的炎性细胞外囊泡（EVs），因此本文研究抑制IRE1A对饮食诱发的脂肪性肝炎小鼠炎性EVs释放的影响。构建模型鼠后，富强内注射IRE1A抑制剂或腺病毒转染小鼠肝脏和原代干细胞，收集后分离EVs进行检测。肝细胞中Ire1a破坏后EVs释放减少，肝损伤、炎症、巨噬细胞局部积累减少。IRE1A靶向编码神经酰胺合成限速酶，导致神经酰胺的生物合成和释放，从而影响EVs的分泌，导致脂肪性肝炎的小鼠肝脏受损。
【前言】非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）特征是肝细胞损伤，被认为是气球样变形和炎症，伴有纤维化，目前缺乏有效的治疗药物。NASH是众多信号通路之间相互作用的结果，包括遗传易感性、肠道营养不良、饮食摄入和脂质代谢异常，进而导致脂质毒性和炎症反应。内质网应激是脂毒性亚致死应激的重要表现，多项研究表明IRE1A-XBP1信号传导与NAFLD的胰岛素抵抗，血脂异常，肝脂肪变性，炎症相关。先前研究中，IRE1A对于从细胞中释放EVs是必须的，而EVs作为介导细胞间相互作用是必须的。目前IRE1A刺激的EVs在NASH中的作用仍然有待研究。
【结果】
NASH中存在脂毒性ER应激反应的激活。构建NASH小鼠模型，用IRE1A抑制剂处理模型鼠后检测Xbp1表达，组织学评估肝脏损伤，IHC和流式检测巨噬细胞浸润，检测巨噬细胞相关mRNA以及释放的因子，TUNEL检测肝细胞凋亡，检测肝脏纤维化相关指标。结果表明：IRE1A抑制剂可减少巨噬细胞浸润，减少肝脏损伤。
构建Ire1a基因敲除鼠，重复上述步骤，检测Xbp1的mRNA，EVs数量，肝功能，巨噬细胞浸润，肝脏纤维化等指标。
IRE1A抑制后循环EVs的数量也相应减少，表明IRE1A可调控肝细胞释放EVs。小鼠注射过表达IRE1A的腺病毒，检测EVs的数量和Xbp1的mRNA表达量，IRE1A抑制剂、IRE1A的RNase做rescue实验验证。对EVs进行表征，检测不同处理状态下的数量。
IRE1A可促进巨噬细胞的募集，诱导肝损伤。腺病毒转染的过表达IRE1A小鼠中IHC和流式分别检测巨噬细胞浸润，检测巨噬细胞相关mRNA和细胞因子表达，进一步流式检测分析髓样细胞来源的巨噬细胞亚型。结果表明：IRE1A可促进促炎型巨噬细胞浸润至肝脏。
IRE1A刺激原代小鼠肝细胞并分离EVs后尾静脉注射进小鼠体内，检测EVs的数量和肝脏对EVs的摄取情况，巨噬细胞浸润情况。结果表明：IRE1A肝细胞来源的EVs可促进巨噬细胞浸润至肝脏，并且展现出促炎表型。
探究IRE1A对EVs释放的调控机制。之前的研究中，脂毒性EVs的释放取决于神经酰胺的从头合成，因此研究IRE1A对神经酰胺从头合成途径的影响。
SPT催化神经酰胺合成的限速酶，因此ChIP实验从转录水平研究IRE1A对SPT的调节。SPT抑制剂抑制神经酰胺合成后检测EVs的数量进一步验证：神经酰胺合成途径对于EVs释放是重要的，而IRE1A可调节神经酰胺合成来调节EVs的合成。
在人类肝脏样本中验证XBP1和SPTLC1与炎症、EVs的数量之间的相关性。