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公司新闻/正文
磷酸酶Shp2通过Syntenin磷酸化来调节sEVs的生物发生
794 人阅读发布时间：2021-07-27 10:15
【关键词】Shp2、Syntenin、生物发生、磷酸酶、小细胞外囊泡sEVs、上皮细胞、巨噬细胞
【前言】sEVs可通过包裹蛋白、脂质、DNA和mRNA来发挥细胞间交流的作用。sEVs的产生源自内体途径，早期内体的内陷形成多囊泡小体MVBs，腔内囊泡ILVs积累，接着MVBs与质膜融合，释放ILVs到细胞外，其中sEVs是纳米级的ILVs。近年来对sEVs的研究越来越多，但是调控其产生的分子机制尚不清楚。Syntenin-Syndecan-ALIX在sEVs的生物发生中起关键作用，Syntenin-Syndecan复合物通过ALIX与ESCRT机械连接，导致MVB处的膜出芽和分裂。乙酰肝素酶、小GTPaseADP核糖基化因子6（ARF6）及其效应磷脂酶D2（PLD2）等可影响sEVs的生物发生。而催化蛋白质磷酸化的激酶也在多种信号通路调节中起关键作用，其中酪氨酸激酶Hck、丙酮酸激酶PKM2等也可调节sEVs的产生。包含Src同源性2的蛋白酪氨酸磷酸酶2（Shp2）是一种在细胞质中普遍表达的非受体酪氨酸磷酸酶，参与肺部多种疾病过程，因此分析上皮Shp2在调节肺泡微环境中的作用将加强对肺部发病机制的了解。
【结果】
许多激酶可通过磷酸化下游信号分子促进sEVs的产生，用各种抑制剂抑制细胞内不同的磷酸酶后检测sEVs的产量和细胞毒性，结果显示：抑制酪氨酸磷酸酶Shp2增加sEVs的产量。接着研究Shp2的去磷酸化功能在sEVs形成中的作用，首先检测不同细胞系Shp2的表达以及对应sEVs的产量，通过NTA、TEM、Cyro-EM和WB表征抑制Shp2后细胞分泌的sEVs。
然后，通过检测总的sEVs蛋白和表面抗原CD9，进一步验证Shp2抑制后细胞分泌更多的sEV。为证明Shp2调节sEV的分泌，作者构建Shp2敲低的稳转株，通过检测sEVs的相关marker（Syntenin、Syndecan-1、TSG101、ALIX、CD9）来说明sEV数量变化。结果显示：Shp2可抑制sEV的生物发生。
从sEVs的形成过程来深入研究Shp2调节sEV的生物发生。sEVs是由MVBs内的ILVs释放至细胞外形成的，因此构建RAB5（Q79L）-GFP与Syntenin-mCherry（指示ILVs）共表达于MCF7和Shp2i-MCF7细胞中，研究Shp2对MVBs中ILV的生物发生调节。Confocal检测药物抑制Shp2后的细胞中Syntenin-mCherry的荧光在RAB5（Q79L）-GFP小内体中增强。TEM结果显示，与对照组相比，ATII细胞干扰Shp2后电镜观察MVBs中ILVs的数量和密度明显增加，且大小无差异。表明：药理学和基因敲除Shp2后可增加MVBs中ILVs的形成来促进sEVs的释放。
sEVs的亚型和组份决定了其在生理和病理状况下的功能，提取Shp2干扰稳转的肺上皮细胞和对照组细胞的sEVs中总蛋白进行质谱分析，对总的蛋白进行功能聚类分析。结果显示：Shp2对sEVs的组份无明显影响。
进一步探究Shp2调节sEV生物发生的分子机制，基于质谱数据分析差异蛋白，作者定位到sEV生成相关蛋白，但WB分析无明显差异。Co-IP实验寻找与Shp2互作的蛋白，结果显示Shp2仅与Syntenin互作。分析酪氨酸磷酸酶Shp2的相对功能，构建Shp2过表达突变体，结果显示：Syntenin以Src依赖的方式通过酪氨酸46位磷酸化的方式调节sEVs的形成。用重组的Shp2活化蛋白进一步验证结果。
逻辑上验证Shp2通过Syntenin Y46位点去磷酸化发挥作用。加入Shp2抑制剂，检测Syntenin的表达量变化及其下游相关作用蛋白PLD2和Y46F位点变化，验证Shp2通过Syntenin Y46位点去磷酸化发挥作用。
肺上皮细胞来源的sEVs通过调节巨噬细胞介导的炎症反应在肺损伤中发挥作用，因此探究Shp2在sEVs介导的上皮细胞和巨噬细胞之间的交互作用，在体外构建共培养系统。，IF检测巨噬细胞摄取PKH67-sEVs的情况，同时将正常肺上皮细胞与Shp2敲低细胞作对比，检测肺上皮细胞来源的sEVs与炎性环境下巨噬细胞之间的交互作用。结果显示：敲低Shp2后，肺上皮细胞来源的sEVs与巨噬细胞之间交互作用加强。
体外构建稳转sh-Shp2的肺上皮细胞，提取其sEVs后处理RAW264.7，诱导细胞表达IL1β, IL6 和 TNFα。接着作者构建Shp2基因敲除鼠，肺泡灌洗液BALF中检测sEVs的含量。分离肺泡巨噬细胞后检测sEVs对巨噬细胞极化的影响。结果显示：Shp2敲低后，肺上皮细胞sEVs产量增加，促进巨噬细胞浸润至肺局部，并且促进巨噬细胞的M1极化。
【摘要】sEVs的生物发生过程通常受到严格的调控，但是目前蛋白磷酸酶在其形成和释放调控中的研究报道很少。本文用药物和shRNA抑制络氨酸磷酸酶Shp2进而促进sEVs的形成。CoIP实验证实Shp2通过去磷酸化Syntenin第46位络氨酸来负调控sEVs的产生。Shp2下调后上皮细胞sEVs产生增加，促进巨噬细胞激活，导致炎症加剧。本文研究提供了上皮-巨噬细胞之间的交互作用的机制。
【结果】
许多激酶可通过磷酸化下游信号分子促进sEVs的产生，用各种抑制剂抑制细胞内不同的磷酸酶后检测sEVs的产量和细胞毒性，结果显示：抑制酪氨酸磷酸酶Shp2增加sEVs的产量。接着研究Shp2的去磷酸化功能在sEVs形成中的作用，首先检测不同细胞系Shp2的表达以及对应sEVs的产量，通过NTA、TEM、Cyro-EM和WB表征抑制Shp2后细胞分泌的sEVs。
然后，通过检测总的sEVs蛋白和表面抗原CD9，进一步验证Shp2抑制后细胞分泌更多的sEV。为证明Shp2调节sEV的分泌，作者构建Shp2敲低的稳转株，通过检测sEVs的相关marker（Syntenin、Syndecan-1、TSG101、ALIX、CD9）来说明sEV数量变化。结果显示：Shp2可抑制sEV的生物发生。
从sEVs的形成过程来深入研究Shp2调节sEV的生物发生。sEVs是由MVBs内的ILVs释放至细胞外形成的，因此构建RAB5（Q79L）-GFP与Syntenin-mCherry（指示ILVs）共表达于MCF7和Shp2i-MCF7细胞中，研究Shp2对MVBs中ILV的生物发生调节。Confocal检测药物抑制Shp2后的细胞中Syntenin-mCherry的荧光在RAB5（Q79L）-GFP小内体中增强。TEM结果显示，与对照组相比，ATII细胞干扰Shp2后电镜观察MVBs中ILVs的数量和密度明显增加，且大小无差异。表明：药理学和基因敲除Shp2后可增加MVBs中ILVs的形成来促进sEVs的释放。
sEVs的亚型和组份决定了其在生理和病理状况下的功能，提取Shp2干扰稳转的肺上皮细胞和对照组细胞的sEVs中总蛋白进行质谱分析，对总的蛋白进行功能聚类分析。结果显示：Shp2对sEVs的组份无明显影响。
进一步探究Shp2调节sEV生物发生的分子机制，基于质谱数据分析差异蛋白，作者定位到sEV生成相关蛋白，但WB分析无明显差异。Co-IP实验寻找与Shp2互作的蛋白，结果显示Shp2仅与Syntenin互作。分析酪氨酸磷酸酶Shp2的相对功能，构建Shp2过表达突变体，结果显示：Syntenin以Src依赖的方式通过酪氨酸46位磷酸化的方式调节sEVs的形成。用重组的Shp2活化蛋白进一步验证结果。
逻辑上验证Shp2通过Syntenin Y46位点去磷酸化发挥作用。加入Shp2抑制剂，检测Syntenin的表达量变化及其下游相关作用蛋白PLD2和Y46F位点变化，验证Shp2通过Syntenin Y46位点去磷酸化发挥作用。
肺上皮细胞来源的sEVs通过调节巨噬细胞介导的炎症反应在肺损伤中发挥作用，因此探究Shp2在sEVs介导的上皮细胞和巨噬细胞之间的交互作用，在体外构建共培养系统。，IF检测巨噬细胞摄取PKH67-sEVs的情况，同时将正常肺上皮细胞与Shp2敲低细胞作对比，检测肺上皮细胞来源的sEVs与炎性环境下巨噬细胞之间的交互作用。结果显示：敲低Shp2后，肺上皮细胞来源的sEVs与巨噬细胞之间交互作用加强。
体外构建稳转sh-Shp2的肺上皮细胞，提取其sEVs后处理RAW264.7，诱导细胞表达IL1β, IL6 和 TNFα。接着作者构建Shp2基因敲除鼠，肺泡灌洗液BALF中检测sEVs的含量。分离肺泡巨噬细胞后检测sEVs对巨噬细胞极化的影响。结果显示：Shp2敲低后，肺上皮细胞sEVs产量增加，促进巨噬细胞浸润至肺局部，并且促进巨噬细胞的M1极化。