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公司新闻/正文
文献解读：FTO通过调节MALAT1甲基化促进膀胱癌的进展
1999 人阅读发布时间：2022-05-07 15:37
N6甲基腺苷（m6A）是真核生物RNA上常见的可逆性修饰，主要发生在RRACH序列中的腺嘌呤上，受writer、eraser和reader蛋白调控，脂肪量和肥胖相关蛋白FTO便是第一个被发现的去甲基化酶，已发现FTO在多种癌症中过度表达，刺激癌细胞代谢，进而诱导肿瘤的发生发展，但关于对FTO在膀胱癌中的作用及机制的了解仍有限。今天为大家带来一篇发表于CLin Transl Med.上的文章，详细介绍了FTO在膀胱癌中的作用及机制。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7851431/
30-50%的膀胱癌发生是由吸烟等致癌物或环境暴露诱发的，但在分子水平上对其致病原因的了解还有待完善，目前发现癌症的分子标志物，如lncRNA转移相关肺腺转录物1（MALAT1）与膀胱癌的预后相关，促进癌症转移；miR-384是肾癌的治疗靶点，能抑制细胞生长；mal T细胞分化蛋白2（MAL2）是促癌因子，但关于它们的作用机制仍未了解。本研究中，作者发现FTO能激活膀胱细胞活力，在体内外促进肿瘤细胞生长，其作用机制是通过调节MALAT1的甲基化和MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌的发生发展。
技术路线：
研究结果：
1．FTO是一种致癌基因，与膀胱癌预后相关
生信分析显示eraser FTO和ALKBH5均与膀胱癌有关，但只有FTO在膀胱癌组织中高度表达，与膀胱癌的不良预后相关，因此作者对FTO做了进一步研究。通过组织IHC分析，相比于正常组织，膀胱癌组织中FTO表达增加，且FTO的表达与膀胱癌的各种临床病理特征密切相关。
2．FTO通过调节MALAT1甲基化促进膀胱癌细胞活力和肿瘤生长
Q-PCR和WB检测发现FTO在253J和T24细胞中表达最高，在5637细胞中表达最低，因此在253J和T24细胞敲低FTO，发现细胞活力会降低30%左右，而在5637细胞中过表达FTO能促进细胞活力。此外对253J小鼠肿瘤模型给予siFTO后，肿瘤重量和体积均降低50%左右，Ki67在肿瘤组织中的表达降低64.6%，表明FTO具有促癌作用。
为确认FTO的靶标，作者对FTO敲除和对照253J细胞进行m6A-seq和RNA-seq测序。结果显示敲除FTO的细胞内poly（A）RNA中的m6A水平增加了1.5倍。鉴于FTO可降低m6A，那么在FTO敲低细胞中具有m6A高甲基化峰的mRNA是其潜在目标，通过m6A-seq数据分析，MALAT1的m6A 修饰水平在FTO敲低后增加最显著，加上前期报道说MALAT1可能介导膀胱癌进展，因此作者对其进行进一步探究。
沉默FTO后可上调MALAT1 5’-End的m6A水平，过表达FTO则降低其m6A水平。通过构建WT和mut MALAT1 5’-End双荧光素酶报告系统，发现敲低FTO后，WT MALAT1报告质粒中的荧光素酶活性降低，而无论FTO敲低或过表达，对突变MALAT1报告质粒中的荧光素酶活性均无影响。同时FTO的敲低能降低MALAT1的RNA水平和半衰期。
reader YTHDF2敲低后能显著增加MALAT1的RNA水平和半衰期，RIP实验证明YTHDF2可结合MALAT1的5'端。此外敲低MALAT1后，可以显著阻断FTO诱导的5367细胞活力增加。说明FTO通过抑制MALAT1 5’端的m6A修饰，提高MALAT1 RNA半衰期和水平，从而促进膀胱癌细胞活力。
3．MALAT1和MAL2与miR-384相互作用以调节膀胱癌细胞活力
生信分析结合starBase v2.0预测出miR-384和MALAT1之间能相互作用，细胞内转染miR-384 inhibitor和mimics后能上调或下调MALAT1的水平，结合双荧光素酶报告基因系统，证实了miR-384和MALAT1之间存在相互作用，同时敲低MALAT1可抵消miR-384 inhibitor对细胞活力的促进作用。同样通过PITA microRNA数据库预测miR-384能结合MAL2,按上述一样的体外实验证实了miR-384能与MAL2相互作用。表明MALAT1可能通过RNA海绵与miR-384相互作用，进一步调节MAL2的表达并促进膀胱癌的进展。
4.FTO通过MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌细胞活力和肿瘤生长
为研究FTO在MALAT1/miR-384/MAL2轴中的作用，作者在细胞中敲低FTO，发现MAL2的表达显著下调，过表达FTO则能上调MAT2。敲低MALAT1则能抵消FTO诱导的MAL2的上调。miR-384 mimics和siMAL2均能抵消FTO过表达对5637细胞活力的促进作用。
在体内，沉默MAL2的5637小鼠肿瘤模型显示出更小体积的肿瘤，且抑制了FTO过表达促进肿瘤进展作用，FTO过表达的肿瘤组织中上调了MAL2的蛋白水平。表明FTO通过MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌细胞增殖。
5.FTO、MALAT1、miR-384和MAL2在膀胱癌患者中具有临床意义
对临床组织进行分析，发现MALAT1和MAL2在膀胱癌组织中高表达，且两者表达水平呈正相关。与正常组织相比，miR-384的表达水平在癌组织中下降了66.3%，与MALAT1和MAL2表达水平呈负相关。且MAL2蛋白表达与FTO的表达及膀胱癌患者的存活率、吸烟状况和病理分期显著相关。表明FTO、MALAT1、miR-384和MAL2都是膀胱癌临床相关的生物标志物。
讨论：
综上所述，FTO被鉴定为参与膀胱癌发生的致癌基因，在癌组织中高表达，与临床病理特征相关，其致癌机制是基于其去甲基化能力和MALAT1/miR-384/MAL2轴调控的，提示FTO具有作为膀胱癌诊断或预后生物标志物的潜力。
附：
1.m6A含量测定
Trizol提取总RNA,使用GeneElute mRNA Miniprep Kit纯化Poly A RNA，使用m6A RNA甲基化检测试剂盒分析总RNA中m6A的含量。即将80ul结合液和200ng样品RNA加入到样本孔中，37℃孵育90min促进RNA结合，每孔用洗涤液洗3次，将50ul稀释的捕获抗体加入到孔中，室温孵育60min，加入增强液，室温孵育30min，加入显色液，室温避光孵育1-10min，再加入终止液，450nm波长下测定。
2.测定mRNA稳定性
用转录抑制剂放线 jun素D处理膀胱癌细胞30分钟后用于收样，于0、3、6小时后收样提取总RNA，合成cDNA，QPCR分析mRNA水平
【欢迎来电/邮件咨询】
电话：021-54376058
手机：18516646410/13917998048（微信同号）
邮箱：yanzaibio@yihaowan.cn, yanzaibio@163.com
地址： 上海市闵行区放鹤路1088号博济科技园6号楼109室
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7851431/
30-50%的膀胱癌发生是由吸烟等致癌物或环境暴露诱发的，但在分子水平上对其致病原因的了解还有待完善，目前发现癌症的分子标志物，如lncRNA转移相关肺腺转录物1（MALAT1）与膀胱癌的预后相关，促进癌症转移；miR-384是肾癌的治疗靶点，能抑制细胞生长；mal T细胞分化蛋白2（MAL2）是促癌因子，但关于它们的作用机制仍未了解。本研究中，作者发现FTO能激活膀胱细胞活力，在体内外促进肿瘤细胞生长，其作用机制是通过调节MALAT1的甲基化和MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌的发生发展。
技术路线：
研究结果：
1．FTO是一种致癌基因，与膀胱癌预后相关
生信分析显示eraser FTO和ALKBH5均与膀胱癌有关，但只有FTO在膀胱癌组织中高度表达，与膀胱癌的不良预后相关，因此作者对FTO做了进一步研究。通过组织IHC分析，相比于正常组织，膀胱癌组织中FTO表达增加，且FTO的表达与膀胱癌的各种临床病理特征密切相关。
2．FTO通过调节MALAT1甲基化促进膀胱癌细胞活力和肿瘤生长
Q-PCR和WB检测发现FTO在253J和T24细胞中表达最高，在5637细胞中表达最低，因此在253J和T24细胞敲低FTO，发现细胞活力会降低30%左右，而在5637细胞中过表达FTO能促进细胞活力。此外对253J小鼠肿瘤模型给予siFTO后，肿瘤重量和体积均降低50%左右，Ki67在肿瘤组织中的表达降低64.6%，表明FTO具有促癌作用。
为确认FTO的靶标，作者对FTO敲除和对照253J细胞进行m6A-seq和RNA-seq测序。结果显示敲除FTO的细胞内poly（A）RNA中的m6A水平增加了1.5倍。鉴于FTO可降低m6A，那么在FTO敲低细胞中具有m6A高甲基化峰的mRNA是其潜在目标，通过m6A-seq数据分析，MALAT1的m6A 修饰水平在FTO敲低后增加最显著，加上前期报道说MALAT1可能介导膀胱癌进展，因此作者对其进行进一步探究。
沉默FTO后可上调MALAT1 5’-End的m6A水平，过表达FTO则降低其m6A水平。通过构建WT和mut MALAT1 5’-End双荧光素酶报告系统，发现敲低FTO后，WT MALAT1报告质粒中的荧光素酶活性降低，而无论FTO敲低或过表达，对突变MALAT1报告质粒中的荧光素酶活性均无影响。同时FTO的敲低能降低MALAT1的RNA水平和半衰期。
reader YTHDF2敲低后能显著增加MALAT1的RNA水平和半衰期，RIP实验证明YTHDF2可结合MALAT1的5'端。此外敲低MALAT1后，可以显著阻断FTO诱导的5367细胞活力增加。说明FTO通过抑制MALAT1 5’端的m6A修饰，提高MALAT1 RNA半衰期和水平，从而促进膀胱癌细胞活力。
3．MALAT1和MAL2与miR-384相互作用以调节膀胱癌细胞活力
生信分析结合starBase v2.0预测出miR-384和MALAT1之间能相互作用，细胞内转染miR-384 inhibitor和mimics后能上调或下调MALAT1的水平，结合双荧光素酶报告基因系统，证实了miR-384和MALAT1之间存在相互作用，同时敲低MALAT1可抵消miR-384 inhibitor对细胞活力的促进作用。同样通过PITA microRNA数据库预测miR-384能结合MAL2,按上述一样的体外实验证实了miR-384能与MAL2相互作用。表明MALAT1可能通过RNA海绵与miR-384相互作用，进一步调节MAL2的表达并促进膀胱癌的进展。
4.FTO通过MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌细胞活力和肿瘤生长
为研究FTO在MALAT1/miR-384/MAL2轴中的作用，作者在细胞中敲低FTO，发现MAL2的表达显著下调，过表达FTO则能上调MAT2。敲低MALAT1则能抵消FTO诱导的MAL2的上调。miR-384 mimics和siMAL2均能抵消FTO过表达对5637细胞活力的促进作用。
在体内，沉默MAL2的5637小鼠肿瘤模型显示出更小体积的肿瘤，且抑制了FTO过表达促进肿瘤进展作用，FTO过表达的肿瘤组织中上调了MAL2的蛋白水平。表明FTO通过MALAT1/miR-384/MAL2轴促进膀胱癌细胞增殖。
5.FTO、MALAT1、miR-384和MAL2在膀胱癌患者中具有临床意义
对临床组织进行分析，发现MALAT1和MAL2在膀胱癌组织中高表达，且两者表达水平呈正相关。与正常组织相比，miR-384的表达水平在癌组织中下降了66.3%，与MALAT1和MAL2表达水平呈负相关。且MAL2蛋白表达与FTO的表达及膀胱癌患者的存活率、吸烟状况和病理分期显著相关。表明FTO、MALAT1、miR-384和MAL2都是膀胱癌临床相关的生物标志物。
讨论：
综上所述，FTO被鉴定为参与膀胱癌发生的致癌基因，在癌组织中高表达，与临床病理特征相关，其致癌机制是基于其去甲基化能力和MALAT1/miR-384/MAL2轴调控的，提示FTO具有作为膀胱癌诊断或预后生物标志物的潜力。
附：
1.m6A含量测定
Trizol提取总RNA,使用GeneElute mRNA Miniprep Kit纯化Poly A RNA，使用m6A RNA甲基化检测试剂盒分析总RNA中m6A的含量。即将80ul结合液和200ng样品RNA加入到样本孔中，37℃孵育90min促进RNA结合，每孔用洗涤液洗3次，将50ul稀释的捕获抗体加入到孔中，室温孵育60min，加入增强液，室温孵育30min，加入显色液，室温避光孵育1-10min，再加入终止液，450nm波长下测定。
2.测定mRNA稳定性
用转录抑制剂放线 jun素D处理膀胱癌细胞30分钟后用于收样，于0、3、6小时后收样提取总RNA，合成cDNA，QPCR分析mRNA水平
【欢迎来电/邮件咨询】
电话：021-54376058
手机：18516646410/13917998048（微信同号）
邮箱：yanzaibio@yihaowan.cn, yanzaibio@163.com
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