​     间充质干细胞(MSCs)释放的细胞外囊泡(EVs)在缺血-再灌注(I/R)急性肾损伤(AKI)动物模型中显示了再生能力， MSC-EVs由于其较高的安全性和较低的免疫原性等天然优势，被认为是MSC治疗的理想替代品。该研究表明，肾I/R损伤时MSC-EVs在肾小管内积聚，通过激活Keap1-Nrf2信号通路，增强肾近端小管上皮细胞(TECs)线粒体功能，促进肾功能恢复。具有聚集诱导发射(AIE)特征的DPA-SCP使MSC-EVs在肾脏修复中的无创和精确的体内显示成为可能。
 
​文章链接：https://dx.doi.org/10.1021/acsnano.9b08207   
技术路线： 研究结果：
1. MSC-EVs的体外标记
         通过超离技术从人胎盘源MSCs (hPMSCs)上清中分离出EVs，将分离的EVs与DPA-SCP孵育进行标记，形成具有AIE特性的DPA-SCP。 
         透射电镜(TEM)结果显示EVs和AIE-EVs均为典型的圆形至椭圆形囊泡，囊泡由双层膜包裹，直径约为120nm，DPA-SCP在EVs表面成功附着。Western Blot结果表明EVs细胞质蛋白(TSG101和ALIX)和表面标记(CD9和CD63)的存在。动态光散射(DLS)检测表示AIE-EVs与EVs尺寸相当。Zeta电位测量表明，两个EVs都带负电荷，EVs(-33.48 mV)和AIE-EVs (-28.74 mV)。紫外分光光度法不同时间间隔检测到EVs和AIE-EVs是紧密结合的。
        通过共聚焦激光扫描显微镜在488nm激光激发下，AIE-EVs的红色荧光信号与Phalloidin染色的细胞骨架的绿色荧光信号共定位，证明了AIE-EVs的内化。使用不同浓度AIE与TEC共孵育48h后，通过细胞增殖实验得知，TEC活力与AIE-EVs的浓度有关，峰值为80 μg。以上结果可知DPA-SCP具有更可控的尺寸和更容易的表面修饰，可以在不改变EVs的结构、组成和功能的情况下直接标记EVs。
2.肾I/R损伤模型中MSC-EVs的体内成像
       使用AIE-EVs 和AIEgens静脉注射AKI小鼠，采用无创荧光成像技术跟踪MSC-EVs在指定时间点的分布，AIE-EVs注射后2h I/R肾荧光信号明显，12h达到峰值，之后下降，而注射AIEgens无荧光。对重要器官的离体荧光生物分布进行观察并对I/R肾定量分析，结果显示，AIE-EVs组的荧光信号分别比AIEgen组高约1.65、6.55和4.44倍。
       PKH26标记的MSC-EVs，体内成像实验发现，PKH26无法实现I/R AKI小鼠MSC-EVs的实时可视化和监测。数据表明AIEgens对商业PKH26在肾I/ R损伤小鼠模型中的MSC-EVs具有更好的标记效力和跟踪能力。DPA-SCP在体内具有较深的组织渗透性、较低的生物背景干扰和较高的生物安全性。
       为进一步验证DPA-SCP在甘油诱导的AKI小鼠模型中的跟踪能力，给药后24，72h，收获并切片肾组织用于CLSM观察。AIE-EVs很容易被标记为用莲花四叶凝集素(LTL)染色的大量近端小管的点状物，表明DPA-SCP具有良好的EVs标记能力。AIEgens在体内I/R诱导和甘油诱导的AKI模型中对EVs的精确和定量跟踪显示了良好的可行性。）
 
3.MSC-EVs对AKI小鼠肾功能的恢复作用
      从较低的BUN (血尿素氮)和肌酸酐(Cr)水平可以看出，AIE-EVs移植后肾功能有显著改善。用免疫染色Kim-1(肾损伤分子-1)和荧光标记LTL来评估近端小管的损伤，结果显示AIE-EVs治疗后近端小管Kim-1明显下调，MSC-EVs治疗后肾损害有限。第7天免疫染色，同时进行实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测4个促炎基因的mRNA水平，结果显示，AIE-EVs组TNF-α表达水平明显低于其他组。Western Blot结果显示，AIE-EVs处理组细胞凋亡基因caspase 8的蛋白水平较其他各组下调，与nf-kb、caspase 9、bax等细胞凋亡基因mRNA表达水平一致。这些数据表明AIE-EVs可以通过调节炎症和抑制细胞凋亡有效地保护肾小管，恢复肾功能。此外，AIEgens不影响MSC-EVs在肾脏中的治疗效果和再生能力。

 
4.MSC-EVs保护TEC线粒体
       利用H2O2体外模拟氧化应激来探讨MSC-EVs是否靶向并保护线粒体功能。分别与MSC-EVs孵育24h，再与100μM H2O2孵育2h。首先检测线粒体的结构完整性。约80%氧化损伤的TECs在24h时出现严重的线粒体断裂。然后，用JC-1的敏感荧光传感器评估线粒体膜电位(Δψm)，氧化损伤导致H2O2处理后24h线粒体去极化严重。与msc - EVs共培养可显著恢复线粒体。RT-qPCR的结果一致。继续使用O2•-传感器MitoSOX检测TECs中的ROS水平。H2O2引起了TECs中ROS的增加。msc - EVs降低ROS水平，表现出抗氧化。Western Blot和RT-qPCR结果显示，MSC-EVs处理显著提高了氧化应激时TECs中Nrf2的mRNA和蛋白表达水平，而降低了Nrf2负调控因子Keap1的表达。MSC-EVs也上调了H2O2处理后TECs中SOD2的表达，表明 MSC-EVs可能通过激活Keap1-Nrf2信号通路来保护线粒体免受氧化损伤。 5.miRNA-200a-3p诱导AKI小鼠Keap1-Nrf2信号通路
      由于EVs转移的microRNA在调节线粒体功能障碍中发挥着关键作用，于是测量了两种抗氧化microRNA: miRNA200a-3p和miRNA-141-3p在术后3天肾组织中的表达水平。MSC-EVs处理显著提高了损伤肾脏中miRNA-200a-3p的表达水平。使用阴性对照抑制剂(NCI)或miRNA200a-3p抑制剂(200aI)转染hPMSCs，从hPMSCs培养的上清中纯化EVs。200aI恢复了MSC-EVs诱导的AKI小鼠模型中下调的Keap1表达，而抑制了MSC-EVs组上调的Nrf2和SOD2表达。
      在I/R诱导的肾损伤后，200aI显著降低了AKI小鼠mtDNA的拷贝数（评价线粒体功能）。MSC-EVs显著提高了AKI小鼠的ATP含量，而200aI-EVs降低了上调的ATP水平。  
6.MSC-EVs通过miRNA-200a-3p调节线粒体功能
        MSC-EVs处理显著增加了TECs中miRNA-200a-3p的水平。经H2O2处理后，miRNA-200a-3p抑制剂抑制了MSC-EVs诱导的Keap1表达下调，而Western Blot检测miRNA-200a-3p抑制了MSC-EVs组Nrf2和SOD2表达上调。在200aI的存在下，MSC-EVs无法在氧化损伤条件下保存TECs的线粒体结构完整性和膜电位。此外，当细胞暴露于H2O2时，200aI也大大降低了mtDNA的拷贝数。总之，基于体外和体内实验，我们得出结论，miRNA-200a-3p通过MSC-EVs穿梭到TECs，靶向Keap1-Nrf2信号通路，并在肾修复中保留了TEC的线粒体功能。

总结：
      该研究表明，这种AIEgen， DPA-SCP，可以无创、准确、安全地检测肾I/R损伤模型中MSC-EVs的行为。DPA-SCP对PKH26表现出卓越的时空分辨率和卓越的灵敏度。MSC-EVs传递的miRNA-200a-3p激活TECs中的Keap1-Nrf2信号通路，发挥抗氧化作用，通过调节线粒体结构和功能帮助恢复肾功能。此外，AIE标记方法安全有效，AIE-EVs通过抑制炎症反应和抑制细胞凋亡促进肾脏修复。

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