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研载生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
【APS】你知道蓝莓外泌体能治疗脂肪肝吗？
1410 人阅读发布时间：2022-06-01 18:31
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是世界上最常见的慢性肝病，线粒体功能障碍和氧化应激在NAFLD的发生和发展中发挥着关键作用。蓝莓具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性，可改善代谢功能和认知能力。该研究筛选了蓝莓来源的外泌体样纳米颗粒(BELNs)，发现BELNs具有抗氧化活性，通过减轻线粒体氧化应激改善非酒精性脂肪肝，可用于NAFLD的治疗。文章发表于Acta pharmacologica Sinica期刊，影响因子: 6.15 (1区Q1)。
研究结果：
1. 蓝莓类外泌体纳米颗粒的筛选和表征
实验收集和筛选了14种可食用植物来源的类外泌体纳米颗粒，通过MTT试验，显示在H2O2处理的人HepG2肝细胞中，BELNs显著提高细胞活力。接着对BELNs进行表征，结果显示：BELNs的尺寸在150~250nm范围内，平均直径为189.62nm；zeta电位为-2.52mV；BELNs以单个外泌体样纳米颗粒的形式出现，具有球形形态；在BELNs中存在RNA，且大多为小尺寸RNA；蛋白的质量在10~250kDa之间；BELNs中含有一系列脂质。
用Dio标记BELNs，观察发现HepG2细胞对BELNs的摄取有时间依赖性。再用鱼藤酮诱导HepG2人肝母细胞瘤细胞模型来评估抗氧化活性。MTT结果显示，在50~200μg/mL范围内，BELNs对HepG2细胞活力无明显影响。
2. BELNs可减轻鱼藤酮诱导的HepG2细胞氧化应激
在鱼藤酮处理的HepG2细胞中，BELNs以剂量依赖的方式显著增加线粒体的含量并抑制ROS的产生。JC-1染色显示鱼藤酮处理的HepG2细胞线粒体膜电位(MMP)显著降低，与BELNs预孵育可有效阻止鱼藤酮对HepG2的影响。
3. BELNs抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡
Western blot检测鱼藤酮处理的HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达，包括Bcl-2、Bax和HO-1。结果显示：鱼藤酮处理降低HepG2中Bcl-2和HO-1蛋白水平，提高Bax蛋白水平。BELNs处理则可以剂量依赖的方式阻止鱼藤酮对HepG2细胞中Bcl-2、Bax和HO-1蛋白水平的影响。TUNEL染色证实，BELNs预处理可明显减弱鱼藤酮诱导的HepG2细胞凋亡。
Western blot检测了Nrf2在鱼藤酮处理的HepG2细胞质和细胞核中的分布，结果显示：鱼藤酮处理后，细胞核中Nrf2含量明显降低，胞质中Nrf2含量明显增加。鱼藤酮对Nrf2分布的影响显著，并加速了Nrf2从细胞质向细胞核的转运。
4. 在HFD喂养的小鼠中，BELNs改善胰岛素抵抗
使用DIR标记BELNs，研究胃内给药后的摄取和分布，表明C57BL/6小鼠可吸收BELNs，并可迅速分布在小肠、肝脏和脾脏等细胞器中。然后，评估BELNs对HFD喂养的小鼠的影响。结果显示：BELNs处理4周对体重或食物摄入量没有显著影响，但明显改善胰岛素抵抗、降低空腹血糖和胰岛素含量。
5. BELNs改善HFD喂养小鼠的肝功能障碍
H&E染色显示，HFD喂养的小鼠肝脏中有许多液泡，补充BELNs可防止液泡形成；油红染色显示，给药BELNs后的小鼠肝脏中脂滴的积累和肝脏重量也显著减少。qRT-PCR结果得，BELNs降低了HFD喂养小鼠肝脏中FAS和ACC1（HFD喂养小鼠肝脏中脂肪从头生成的两个关键转录因子）的mRNA水平。
6. 在HFD喂养小鼠肝脏中，BELNs减轻氧化应激并调节凋亡相关蛋白的表达
研究测定连续四周给药BELNs经HFD饮食喂养的小鼠肝脏中抗氧化酶的活性。结果表明添加BELNs能有效降低HFD喂养小鼠肝脏中MDA的含量，提高SOD和GSH（两个重要抗氧化的酶）的活性。接着测定了Bcl-2、Bax和HO-1在BELNs给药的HFD小鼠中的表达。Western blot结果显示BELNs处理Bcl-2和HO-1蛋白水平上升，Bax蛋白水平下降。
测定Nrf2在HFD喂养小鼠肝细胞中的分布。Western blot结果显示，HFD诱导Nrf2在肝脏细胞质中轻微增加，但添加BELNs加速了Nrf2从细胞质向细胞核的转运。免疫化学结果进一步证实了BELNs对HFD喂养小鼠肝脏中Nrf2分布的影响。
总结：
蓝莓来源的可食用纳米颗粒BELNs可被HepG2细胞和C57BL/6小鼠吸收，并迅速穿透肠道粘液屏障进入肝脏和脾脏，通过其抗氧化活性降低鱼藤酮诱导的HepG2细胞凋亡，降低FAS和ACC1在HFD喂养小鼠肝脏中的表达，从而可作为一种新型抗氧化剂用于治疗非酒精性脂肪肝。
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41401-021-00681-w
技术路线：
1. 蓝莓类外泌体纳米颗粒的筛选和表征
实验收集和筛选了14种可食用植物来源的类外泌体纳米颗粒，通过MTT试验，显示在H2O2处理的人HepG2肝细胞中，BELNs显著提高细胞活力。接着对BELNs进行表征，结果显示：BELNs的尺寸在150~250nm范围内，平均直径为189.62nm；zeta电位为-2.52mV；BELNs以单个外泌体样纳米颗粒的形式出现，具有球形形态；在BELNs中存在RNA，且大多为小尺寸RNA；蛋白的质量在10~250kDa之间；BELNs中含有一系列脂质。
用Dio标记BELNs，观察发现HepG2细胞对BELNs的摄取有时间依赖性。再用鱼藤酮诱导HepG2人肝母细胞瘤细胞模型来评估抗氧化活性。MTT结果显示，在50~200μg/mL范围内，BELNs对HepG2细胞活力无明显影响。
2. BELNs可减轻鱼藤酮诱导的HepG2细胞氧化应激
在鱼藤酮处理的HepG2细胞中，BELNs以剂量依赖的方式显著增加线粒体的含量并抑制ROS的产生。JC-1染色显示鱼藤酮处理的HepG2细胞线粒体膜电位(MMP)显著降低，与BELNs预孵育可有效阻止鱼藤酮对HepG2的影响。
3. BELNs抑制鱼藤酮诱导的细胞凋亡
Western blot检测鱼藤酮处理的HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达，包括Bcl-2、Bax和HO-1。结果显示：鱼藤酮处理降低HepG2中Bcl-2和HO-1蛋白水平，提高Bax蛋白水平。BELNs处理则可以剂量依赖的方式阻止鱼藤酮对HepG2细胞中Bcl-2、Bax和HO-1蛋白水平的影响。TUNEL染色证实，BELNs预处理可明显减弱鱼藤酮诱导的HepG2细胞凋亡。
Western blot检测了Nrf2在鱼藤酮处理的HepG2细胞质和细胞核中的分布，结果显示：鱼藤酮处理后，细胞核中Nrf2含量明显降低，胞质中Nrf2含量明显增加。鱼藤酮对Nrf2分布的影响显著，并加速了Nrf2从细胞质向细胞核的转运。
使用DIR标记BELNs，研究胃内给药后的摄取和分布，表明C57BL/6小鼠可吸收BELNs，并可迅速分布在小肠、肝脏和脾脏等细胞器中。然后，评估BELNs对HFD喂养的小鼠的影响。结果显示：BELNs处理4周对体重或食物摄入量没有显著影响，但明显改善胰岛素抵抗、降低空腹血糖和胰岛素含量。
5. BELNs改善HFD喂养小鼠的肝功能障碍
H&E染色显示，HFD喂养的小鼠肝脏中有许多液泡，补充BELNs可防止液泡形成；油红染色显示，给药BELNs后的小鼠肝脏中脂滴的积累和肝脏重量也显著减少。qRT-PCR结果得，BELNs降低了HFD喂养小鼠肝脏中FAS和ACC1（HFD喂养小鼠肝脏中脂肪从头生成的两个关键转录因子）的mRNA水平。
6. 在HFD喂养小鼠肝脏中，BELNs减轻氧化应激并调节凋亡相关蛋白的表达
研究测定连续四周给药BELNs经HFD饮食喂养的小鼠肝脏中抗氧化酶的活性。结果表明添加BELNs能有效降低HFD喂养小鼠肝脏中MDA的含量，提高SOD和GSH（两个重要抗氧化的酶）的活性。接着测定了Bcl-2、Bax和HO-1在BELNs给药的HFD小鼠中的表达。Western blot结果显示BELNs处理Bcl-2和HO-1蛋白水平上升，Bax蛋白水平下降。
测定Nrf2在HFD喂养小鼠肝细胞中的分布。Western blot结果显示，HFD诱导Nrf2在肝脏细胞质中轻微增加，但添加BELNs加速了Nrf2从细胞质向细胞核的转运。免疫化学结果进一步证实了BELNs对HFD喂养小鼠肝脏中Nrf2分布的影响。
总结：
蓝莓来源的可食用纳米颗粒BELNs可被HepG2细胞和C57BL/6小鼠吸收，并迅速穿透肠道粘液屏障进入肝脏和脾脏，通过其抗氧化活性降低鱼藤酮诱导的HepG2细胞凋亡，降低FAS和ACC1在HFD喂养小鼠肝脏中的表达，从而可作为一种新型抗氧化剂用于治疗非酒精性脂肪肝。