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公司新闻/正文
外泌体+肿瘤耐药性怎么研究？或许这篇9分+文章能给你点思路
1509 人阅读发布时间：2022-06-21 10:00
胰腺癌(PC)是一种严重的恶性疾病，由于早期症状隐蔽、诊断延迟和对放化疗不敏感，5年生存率低于8%。想要提高生存的几率，特别是晚期PC，主要靠辅助化疗。目前PC的化疗方案主要是吉西他滨(GEM)或基于GEM的联合方案。但在临床应用中，PC对GEM具有明显的先天和获得性耐药性，显著降低了疗效。
外泌体作为目前肿瘤学研究的热点，参与PC的发生发展，诱导其形成免疫耐受和化疗耐药性。越来越多的证据表明，外泌体环状RNA失调与化疗耐药性相关。PC耐药性又与缺氧密切相关，但其确切机制尚未完全阐明。该研究就报道了一种低氧外泌体环状RNA (circRNA)介导的PC细胞化疗耐药机制，对PC的治疗和预后具有重要价值。相关研究成果发表在Oncogene期刊上，IF：9.867。
技术路线：
研究结果：
1. 在常氧的癌细胞中，circZNF91对于低氧外泌体促进的GEM耐药至关重要
PC细胞在常氧/缺氧条件下培养48h，收集培养基为常氧CM/缺氧CM。结果表明，低氧CM培养的细胞对GEM的IC50增加，低氧CM可能含有促进因子赋予常氧PC细胞耐药能力。
电子显微镜显示，低氧癌细胞比正常癌细胞分泌更多外泌体。荧光染料PKH26标记外泌体，验证了低氧外泌体可以融合到受体常氧细胞。低氧外泌体培育的细胞在GEM处理下IC50显著增加，表明低氧PC细胞来源的外泌体可以增强常氧PC细胞对GEM的抗性。
实验应用微阵列技术分析了常氧外泌体和低氧外泌体之间分化的circRNA，重点研究circZNF91。结果表明，circZNF91在BxPC-3细胞中比线性ZNF91更稳定。与芯片结果一致，circZNF91在PC细胞缺氧外泌体中上调。因此，缺氧的PC细胞可能通过外泌体负载将circZNF91传递给常氧细胞。
敲低circZNF91，抑制PC的GEM耐药，不影响ZNF91 mRNA的表达。过表达circZNF91，促进GEM耐药，不影响ZNF91 mRNA的表达。过表达或缺氧的PC-Exo增强了PC中circZNF91的表达和GEM抗性，低氧PC-Exo相反。结果表明了circZNF91在调控GEM抗性中的关键作用。
为了验证外泌体的关键作用，通过消耗RAB27A/B或用GW4869抑制中性鞘磷脂酶-2(NSMase)来减少外泌体的产生。通过RAB27A/B敲低或GW4869抑制外泌体释放，可抑制低氧CM介导的GEM耐药在PC细胞中的传递，但能被来自低氧和circZNF91过表达PC细胞的外泌体拯救。
2. 外泌体circZNF91可作为miR-23b-3p的分子海绵
通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证circZNF91与Ago蛋白的结合。miR-23b-3p过表达导致circZNF91对Ago2的富集增加，表明circZNF91是miR-23b-3p与Ago2的结合平台。将携带预测的circZNF91 miR-23b-3p靶向区(WT)或突变区(MUT)的荧光素酶报告基因转染BxPC-3细胞。在转染WT-circZNF91质粒的细胞中，过表达miR-23b-3p后荧光素酶活性降低，抑制miR-23b-3p后活性升高，表明circZNF91与miR-23b-3p结合。实验用MS2 RNA发夹标记circZNF91的野生型和突变型序列，发现circZNF91-MS2 (WT)可以在BxPC-3细胞中捕获miR-23b-3p，而circZNF91-MS2 (MUT)不能。结果显示miR-23b-3p显著阻碍了PC细胞的GEM耐药，circZNF91过表达消除了这种作用。同样，PC细胞的GEM抗性由circznf91过表达PC细胞或缺氧PC细胞分泌的外泌体促进，miR-23b-3p的上调显著抑制。
3. circZNF91通过竞争性结合miR-23b-3p上调SIRT1的表达
circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了SIRT1的mRNA和蛋白水平，miR-23b-3p上调可逆转这一变化。此外，在BxPC-3细胞中使用ActD阻断RNA合成后，在检测SIRT1转录稳定方面也取得了类似的趋势。荧光素酶报告基因进一步研究，circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了WT-3'UTR-SIRT1，miR-23b-3p过表达可消除。此外，MS2- trap实验显示SIRT1在3'UTR-SIRT1-MS2过表达的细胞中被大量捕获。RIP结果显示，miR-23b-3p过表达导致Ago2在SIRT1转录本上富集增加。敲低SIRT1可以逆转circZNF91和低氧外泌体增强PC细胞耐药的作用。
4. 外泌体circZNF91通过sirt1依赖的去乙酰化稳定HIF-1α蛋白
实验显示circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了BxPC-3/SW1990细胞中HIF-1α蛋白的稳定性。此外，蛋白酶体抑制剂MG132可以消除circZNF91过表达或低氧外泌体诱导的HIF-1α的升高。Co-IP实验显示circZNF91过表达和低氧外泌体均可增加HIF-1α与SIRT1的结合，降低HIF-1α的乙酰化，而miR-23b-3p过表达可消除这种影响。结果表明，低氧外泌体circZNF91通过促进miR-23b-3p/ sirt1介导的HIF-1α蛋白的稳定性，增强常氧PC细胞的GEM抗性。
5. 低氧外泌体circZNF91通过增强HIF-1α调控的糖酵解促进常氧PC细胞的GEM抗性
缺氧外泌体增加了葡萄糖的消耗，乳酸的产生，并降低了细胞外pH值，而circZNF91的下调可以消除这种作用。染色质免疫沉淀(ChIP)实验显示在低氧外泌体处理的PC细胞中，GLUT1、LDHA、HK2和PKM2的mRNA和蛋白水平显著升高，而下调circZNF91可以逆转这种升高。使用di高辛、YC-1或siRNA-HIF-1α抑制HIF-1α的活性。结果表明，抑制HIF-1α活性可显著抑制低氧外泌体诱导的糖酵解基因的表达和常氧PC细胞的GEM抗性。miR-23b-3p过表达细胞中糖酵解酶和HIF-1α的mRNA和蛋白水平显著降低，通过上调SIRT1恢复。结果显示circZNF91/miR-23b-3p/SIRT1通路参与调控hif -1α相关糖酵解。
6. 外泌体circZNF91在缺氧条件下被HIF-1α转录上调
最近的研究表明，在缺氧条件下，环状RNA的一个亚群受到HIF-1α的转录调控。通过ChIP实验，荧光素酶报告基因检测，验证了缺氧诱导的细胞内circZNF91的增加被HIF-1α的消耗明显抑制。在缺氧外泌体处理的受体PC细胞中，circZNF91和糖酵解基因的表达显著增加，但通过敲低HIF-1α可明显抑制。因此，进一步支持了circZNF91传递到受体PC细胞后，通过剥夺miR-23b-3p对SIRT1的抑制，进一步增强了HIF-1α的稳定，间接促进了circZNF91的内源性转录，形成了正反馈。
7. 靶向circZNF91/miR-23b-3p阻碍低氧外泌体促进的PC体内化疗耐药性
实验使用BxPC-3细胞构建裸鼠移植瘤模型。这些细胞被皮下注射到裸鼠的右臀部。然后每3天将纯化的外泌体和siCircZNF91/miR-23b-3p mimic混合液注入瘤内。RT-qPCR分析显示，注射低氧外泌体的肿瘤中，circZNF91表达增加。在注射缺氧外泌体的肿瘤中，miR-23b-3p的表达显著降低，SIRT1和糖酵解基因的mRNA水平升高，circZNF91敲低和miR-23b-3p上调可逆转这一变化。Western blot和免疫组化(IHC)检测显示，在缺氧外泌体处理的肿瘤中，SIRT1、HIF-1α和糖酵解基因表达上调，circZNF91敲低和miR-23b-3p上调可恢复。低氧外泌体和circZNF91过表达可轻微促进细胞增殖，siCircZNF91和miR-23b-3p分别可逆转细胞增殖。因此，上述结果说明circZNF91/miR-23b-3p是治疗GEM耐药和增殖的潜在靶点。
8. CircZNF91在PC组织中过表达，与预后不良相关
为证明circZNF91的临床相关性，实验检测了配对的非肿瘤瘤周(NP)组织、PC组织和PC患者血浆中circZNF91的表达。circZNF91在PC组织中的表达明显升高。实验发现在PC组织中，SIRT1的mRNA水平与circZNF91呈正相关，而与miR23b-3p呈负相关。GLUT1的mRNA表达水平与circZNF91呈正相关。免疫组化/免疫荧光(IF)分析显示，SIRT1、HIF-1α和糖酵解酶在circZNF91高表达的PC组织中高表达。因此，这些数据表明HIF-1α/circZNF91/miR23b-3p通路参与了PC的肿瘤发生。
总结：
在常氧状态下，缺氧的PC细胞可以激活远处癌细胞的缺氧信号。CircZNF91富含来自低氧PC细胞的外泌体，这对于促进常氧PC细胞的糖酵解和化学抗性至关重要。进一步发现，缺氧诱导的外泌体circZNF91受HIF-1α的转录调控。然而，低氧外泌体来源的circZNF91海绵吸附miR-23b3p以提高SIRT1的表达，这有助于常氧PC细胞HIF-1α蛋白的去乙酰化依赖性稳定。
外泌体作为目前肿瘤学研究的热点，参与PC的发生发展，诱导其形成免疫耐受和化疗耐药性。越来越多的证据表明，外泌体环状RNA失调与化疗耐药性相关。PC耐药性又与缺氧密切相关，但其确切机制尚未完全阐明。该研究就报道了一种低氧外泌体环状RNA (circRNA)介导的PC细胞化疗耐药机制，对PC的治疗和预后具有重要价值。相关研究成果发表在Oncogene期刊上，IF：9.867。
技术路线：
1. 在常氧的癌细胞中，circZNF91对于低氧外泌体促进的GEM耐药至关重要
PC细胞在常氧/缺氧条件下培养48h，收集培养基为常氧CM/缺氧CM。结果表明，低氧CM培养的细胞对GEM的IC50增加，低氧CM可能含有促进因子赋予常氧PC细胞耐药能力。
电子显微镜显示，低氧癌细胞比正常癌细胞分泌更多外泌体。荧光染料PKH26标记外泌体，验证了低氧外泌体可以融合到受体常氧细胞。低氧外泌体培育的细胞在GEM处理下IC50显著增加，表明低氧PC细胞来源的外泌体可以增强常氧PC细胞对GEM的抗性。
实验应用微阵列技术分析了常氧外泌体和低氧外泌体之间分化的circRNA，重点研究circZNF91。结果表明，circZNF91在BxPC-3细胞中比线性ZNF91更稳定。与芯片结果一致，circZNF91在PC细胞缺氧外泌体中上调。因此，缺氧的PC细胞可能通过外泌体负载将circZNF91传递给常氧细胞。
敲低circZNF91，抑制PC的GEM耐药，不影响ZNF91 mRNA的表达。过表达circZNF91，促进GEM耐药，不影响ZNF91 mRNA的表达。过表达或缺氧的PC-Exo增强了PC中circZNF91的表达和GEM抗性，低氧PC-Exo相反。结果表明了circZNF91在调控GEM抗性中的关键作用。
为了验证外泌体的关键作用，通过消耗RAB27A/B或用GW4869抑制中性鞘磷脂酶-2(NSMase)来减少外泌体的产生。通过RAB27A/B敲低或GW4869抑制外泌体释放，可抑制低氧CM介导的GEM耐药在PC细胞中的传递，但能被来自低氧和circZNF91过表达PC细胞的外泌体拯救。
2. 外泌体circZNF91可作为miR-23b-3p的分子海绵
通过RNA免疫沉淀(RIP)实验验证circZNF91与Ago蛋白的结合。miR-23b-3p过表达导致circZNF91对Ago2的富集增加，表明circZNF91是miR-23b-3p与Ago2的结合平台。将携带预测的circZNF91 miR-23b-3p靶向区(WT)或突变区(MUT)的荧光素酶报告基因转染BxPC-3细胞。在转染WT-circZNF91质粒的细胞中，过表达miR-23b-3p后荧光素酶活性降低，抑制miR-23b-3p后活性升高，表明circZNF91与miR-23b-3p结合。实验用MS2 RNA发夹标记circZNF91的野生型和突变型序列，发现circZNF91-MS2 (WT)可以在BxPC-3细胞中捕获miR-23b-3p，而circZNF91-MS2 (MUT)不能。结果显示miR-23b-3p显著阻碍了PC细胞的GEM耐药，circZNF91过表达消除了这种作用。同样，PC细胞的GEM抗性由circznf91过表达PC细胞或缺氧PC细胞分泌的外泌体促进，miR-23b-3p的上调显著抑制。
3. circZNF91通过竞争性结合miR-23b-3p上调SIRT1的表达
circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了SIRT1的mRNA和蛋白水平，miR-23b-3p上调可逆转这一变化。此外，在BxPC-3细胞中使用ActD阻断RNA合成后，在检测SIRT1转录稳定方面也取得了类似的趋势。荧光素酶报告基因进一步研究，circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了WT-3'UTR-SIRT1，miR-23b-3p过表达可消除。此外，MS2- trap实验显示SIRT1在3'UTR-SIRT1-MS2过表达的细胞中被大量捕获。RIP结果显示，miR-23b-3p过表达导致Ago2在SIRT1转录本上富集增加。敲低SIRT1可以逆转circZNF91和低氧外泌体增强PC细胞耐药的作用。
4. 外泌体circZNF91通过sirt1依赖的去乙酰化稳定HIF-1α蛋白
实验显示circZNF91过表达和低氧外泌体显著提高了BxPC-3/SW1990细胞中HIF-1α蛋白的稳定性。此外，蛋白酶体抑制剂MG132可以消除circZNF91过表达或低氧外泌体诱导的HIF-1α的升高。Co-IP实验显示circZNF91过表达和低氧外泌体均可增加HIF-1α与SIRT1的结合，降低HIF-1α的乙酰化，而miR-23b-3p过表达可消除这种影响。结果表明，低氧外泌体circZNF91通过促进miR-23b-3p/ sirt1介导的HIF-1α蛋白的稳定性，增强常氧PC细胞的GEM抗性。
5. 低氧外泌体circZNF91通过增强HIF-1α调控的糖酵解促进常氧PC细胞的GEM抗性
缺氧外泌体增加了葡萄糖的消耗，乳酸的产生，并降低了细胞外pH值，而circZNF91的下调可以消除这种作用。染色质免疫沉淀(ChIP)实验显示在低氧外泌体处理的PC细胞中，GLUT1、LDHA、HK2和PKM2的mRNA和蛋白水平显著升高，而下调circZNF91可以逆转这种升高。使用di高辛、YC-1或siRNA-HIF-1α抑制HIF-1α的活性。结果表明，抑制HIF-1α活性可显著抑制低氧外泌体诱导的糖酵解基因的表达和常氧PC细胞的GEM抗性。miR-23b-3p过表达细胞中糖酵解酶和HIF-1α的mRNA和蛋白水平显著降低，通过上调SIRT1恢复。结果显示circZNF91/miR-23b-3p/SIRT1通路参与调控hif -1α相关糖酵解。
6. 外泌体circZNF91在缺氧条件下被HIF-1α转录上调
最近的研究表明，在缺氧条件下，环状RNA的一个亚群受到HIF-1α的转录调控。通过ChIP实验，荧光素酶报告基因检测，验证了缺氧诱导的细胞内circZNF91的增加被HIF-1α的消耗明显抑制。在缺氧外泌体处理的受体PC细胞中，circZNF91和糖酵解基因的表达显著增加，但通过敲低HIF-1α可明显抑制。因此，进一步支持了circZNF91传递到受体PC细胞后，通过剥夺miR-23b-3p对SIRT1的抑制，进一步增强了HIF-1α的稳定，间接促进了circZNF91的内源性转录，形成了正反馈。
7. 靶向circZNF91/miR-23b-3p阻碍低氧外泌体促进的PC体内化疗耐药性
实验使用BxPC-3细胞构建裸鼠移植瘤模型。这些细胞被皮下注射到裸鼠的右臀部。然后每3天将纯化的外泌体和siCircZNF91/miR-23b-3p mimic混合液注入瘤内。RT-qPCR分析显示，注射低氧外泌体的肿瘤中，circZNF91表达增加。在注射缺氧外泌体的肿瘤中，miR-23b-3p的表达显著降低，SIRT1和糖酵解基因的mRNA水平升高，circZNF91敲低和miR-23b-3p上调可逆转这一变化。Western blot和免疫组化(IHC)检测显示，在缺氧外泌体处理的肿瘤中，SIRT1、HIF-1α和糖酵解基因表达上调，circZNF91敲低和miR-23b-3p上调可恢复。低氧外泌体和circZNF91过表达可轻微促进细胞增殖，siCircZNF91和miR-23b-3p分别可逆转细胞增殖。因此，上述结果说明circZNF91/miR-23b-3p是治疗GEM耐药和增殖的潜在靶点。
8. CircZNF91在PC组织中过表达，与预后不良相关
为证明circZNF91的临床相关性，实验检测了配对的非肿瘤瘤周(NP)组织、PC组织和PC患者血浆中circZNF91的表达。circZNF91在PC组织中的表达明显升高。实验发现在PC组织中，SIRT1的mRNA水平与circZNF91呈正相关，而与miR23b-3p呈负相关。GLUT1的mRNA表达水平与circZNF91呈正相关。免疫组化/免疫荧光(IF)分析显示，SIRT1、HIF-1α和糖酵解酶在circZNF91高表达的PC组织中高表达。因此，这些数据表明HIF-1α/circZNF91/miR23b-3p通路参与了PC的肿瘤发生。
总结：
在常氧状态下，缺氧的PC细胞可以激活远处癌细胞的缺氧信号。CircZNF91富含来自低氧PC细胞的外泌体，这对于促进常氧PC细胞的糖酵解和化学抗性至关重要。进一步发现，缺氧诱导的外泌体circZNF91受HIF-1α的转录调控。然而，低氧外泌体来源的circZNF91海绵吸附miR-23b3p以提高SIRT1的表达，这有助于常氧PC细胞HIF-1α蛋白的去乙酰化依赖性稳定。