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研载生物科技（上海）有限公司
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【CDD】8分+，经典套路解锁骨髓间充质干细胞外泌体缓解血管钙化的机制研究
613 人阅读发布时间：2022-06-17 13:43
血管钙化(VC)是慢性肾脏疾病(CKD)的重要并发症。凋亡小体导致钙和磷酸盐的沉积，并发展成为钙化的核心，在VC的发展中发挥关键作用。近年来，骨髓间充质干细胞来源的外泌体(BMSC-Exo)的治疗作用越来越受到关注，之前的研究中发现BMSC-Exo可以缓解VC，但其机制尚不清楚。
本研究旨在探讨BMSC-Exo在CKD-VC中的抗凋亡和抗钙化作用，阐明其机制，不仅有助于更好地理解BMSC-Exo的保护作用，而且为CKD-VC的治疗提供一种潜在的策略。相关研究成果发表在Cell death & disease上，IF:8.469。
技术路线：
研究结果：
1. BMSC-Exo抑制高Pi诱导的HA-VSMCs的凋亡和钙化
通过透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)、Western blot对BMSC-Exo进行表征检测。外泌体摄取实验采用高磷酸盐刺激的人主动脉平滑肌细胞(HAVSMCs)，证明了HA-VSMCs内化了BMSC-Exo。
实验用2.5mM Pi刺激HA-VSMCs 3、14、21天，14天后细胞出现明显钙化。2.5mM Pi，2.5mM Pi+Exo，NC分组刺激HA-VSMCs14天，观察细胞钙化情况，并检测细胞中凋亡指标的表达水平进行Western blot分析，结果说明BMSC-Exo改善Pi诱导的HA-VSMCs的凋亡和VC。此外，实验还证明了BMSC-Exo的钙化保护作用是由外泌体封闭的物质而不是其他来源的RNA/蛋白所引起的。
2. BMSC-Exo对钙化的抑制作用部分依赖于miR-381-3p
MiRNA微阵列分析来识别HA-VSMCs中Pi和Pi+Exo组之间差异表达的miRNA (DEM)，对选中的4个上调miRNA进行RT-qPCR检测，最终选择miR-381-3p作为进一步研究的靶点。实验分为两组：BMSC-ExoΔ组（沉默miR-381-3p的表达）与BMSC-Exo组。茜素红S染色、Ca2+含量测定和AKP活性分析显示，BMSC-ExoΔ对钙化的抑制作用明显弱于BMSC-Exo。对凋亡指标的评估，发现BMSC-ExoΔ组，对BAX、裂解的caspase3的抑制和BCL-2的增强均被消除。流式细胞仪分析得知BMSC-Exo显著抑制细胞凋亡，BMSC-ExoΔ对细胞凋亡无明显抑制作用。结果表明，miR-381-3p参与了BMSC-Exo的抗钙化和抗凋亡作用。
3. MiR-381-3p通过直接靶向NFAT5抑制HA-VSMCs的钙化和凋亡
通过微阵列分析，并推测NFAT5可能是mir-381-3p介导的钙化调控的靶基因。双荧光素酶报告基因实验进行了验证，得知miR-381-3p可以直接与NFAT5 mRNA的3'UTR序列结合。对转染了miR-381-3p模拟物的HA-VSMCs中NFAT5蛋白和mRNA表达水平进行了评估，模拟物下调NFAT5的蛋白和mRNA水平。在HA-VSMCs中应用BMSC-Exo后，NFAT5 mRNA和蛋白表达水平也是下调。表明，miR-381-3p通过直接靶向NFAT5 mRNA 3'UTR序列调控其表达。
Si-NFAT5转染HA-VSMCs后，NFAT5的mRNA和蛋白表达显著降低，miR-381-3p的表达未受影响。钙沉积和凋亡相关指标检测，结果表明，NFAT5的下调抑制了高Pi诱导的细胞凋亡和钙化。MiR-381-3p模拟物(100nM)和人NFAT5过表达质粒(oe-NFAT5)共转染HA-VSMCs，检测共转染后凋亡和钙化情况，相关凋亡指标。oe-NFAT5显著加剧了细胞的凋亡和钙化，而oe-NFAT5大大减弱了miR-381-3p模拟物的抑制作用，表明NFAT5对于外泌体miR-381-3p的抗钙化和抗凋亡作用至关重要。
Figure 5 MiR-381-3p通过靶向NFAT5抑制凋亡和VC
4. BMSC-Exo对SNx大鼠细胞凋亡及VC的治疗作用
实验用5/6SNx大鼠建立稳定的VC模型。术后16周SNx组大鼠较SNx+Exo组和SHAM组大鼠明显变瘦。较SHAM组，SNx组Scr和BUN水平升高，BMSC-Exo处理后Scr和BUN水平降低。因此，BMSC-Exo延长了SNx大鼠的生命，并改善了肾功能。
SNx大鼠16周后，主动脉的茜素红S和Von Kossa (V-K)染色均呈阳性，SHAM组钙沉积少。定量了Ca2+含量和AKP活性，SNx后胸主动脉Ca2+含量和AKP活性明显升高，BMSC-Exo治疗可缓解上述变化。TUNEL检测胸主动脉细胞凋亡，SHAM组凋亡细胞较少，而SNx组大量凋亡细胞随血管介质分布，与钙沉积分布相似，BMSC-Exo处理后TUNEL阳性减少。RT-qPCR和Western blot显示BMSC-Exo降低了SNx引起的BAX和裂解的caspase3表达，增加了SNx引起的BCL-2的mRNA和蛋白水平，提示BMSC-Exo减轻了SNx诱导的胸主动脉细胞凋亡。
Figure 6 BMSC-Exo对5/6 SNx大鼠生存、肾功能、细胞凋亡及VC的治疗作用
5. 在体内，Exo-miR-381-3p/ NFAT5轴参与抗钙化作用
BMSC-Exo处理SNx大鼠，上调miR-381-3p，下调NFAT5的表达。验证Exo-miR-381-3p/NFAT5轴在透析患者中的作用，将其分为VC组和非VC组。TUNEL检测显示VC组血管介质中有大量凋亡细胞分布，RT-qPCR结果证实，nVC组血管组织中miR-381-3p的表达明显高于VC组，miR-381-3p可能对透析患者VC有保护作用。免疫组化显示VC组NFAT5阳性染色明显增加，NFAT5在VC中发挥了潜在的恶化作用。
Figure 7 BMSC-Exo通过调节miR-381-3p/NFAT5轴抑制5/6SNx大鼠胸主动脉的凋亡
总结：
研究发现BMSC-Exo通过传递miR-381-3p并抑制其靶基因NFAT5，进而抑制VSMCs的凋亡，从而发挥其抑制血管钙化的作用。不仅揭示了miR-381-3p/NFAT5在调控细胞凋亡/ VC中的重要作用，也拓展了对BMSC-Exo在CKD-VC等复杂机制疾病中的调控作用的认识。
本研究旨在探讨BMSC-Exo在CKD-VC中的抗凋亡和抗钙化作用，阐明其机制，不仅有助于更好地理解BMSC-Exo的保护作用，而且为CKD-VC的治疗提供一种潜在的策略。相关研究成果发表在Cell death & disease上，IF:8.469。
技术路线：
1. BMSC-Exo抑制高Pi诱导的HA-VSMCs的凋亡和钙化
通过透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)、Western blot对BMSC-Exo进行表征检测。外泌体摄取实验采用高磷酸盐刺激的人主动脉平滑肌细胞(HAVSMCs)，证明了HA-VSMCs内化了BMSC-Exo。
实验用2.5mM Pi刺激HA-VSMCs 3、14、21天，14天后细胞出现明显钙化。2.5mM Pi，2.5mM Pi+Exo，NC分组刺激HA-VSMCs14天，观察细胞钙化情况，并检测细胞中凋亡指标的表达水平进行Western blot分析，结果说明BMSC-Exo改善Pi诱导的HA-VSMCs的凋亡和VC。此外，实验还证明了BMSC-Exo的钙化保护作用是由外泌体封闭的物质而不是其他来源的RNA/蛋白所引起的。
Figure 1 BMSC-Exo抑制HA-VSMC的凋亡和VC
2. BMSC-Exo对钙化的抑制作用部分依赖于miR-381-3p
MiRNA微阵列分析来识别HA-VSMCs中Pi和Pi+Exo组之间差异表达的miRNA (DEM)，对选中的4个上调miRNA进行RT-qPCR检测，最终选择miR-381-3p作为进一步研究的靶点。实验分为两组：BMSC-ExoΔ组（沉默miR-381-3p的表达）与BMSC-Exo组。茜素红S染色、Ca2+含量测定和AKP活性分析显示，BMSC-ExoΔ对钙化的抑制作用明显弱于BMSC-Exo。对凋亡指标的评估，发现BMSC-ExoΔ组，对BAX、裂解的caspase3的抑制和BCL-2的增强均被消除。流式细胞仪分析得知BMSC-Exo显著抑制细胞凋亡，BMSC-ExoΔ对细胞凋亡无明显抑制作用。结果表明，miR-381-3p参与了BMSC-Exo的抗钙化和抗凋亡作用。
Figure 2 BMSC-Exo抑制钙化的作用依赖于miR-381-3p
3. MiR-381-3p通过直接靶向NFAT5抑制HA-VSMCs的钙化和凋亡
Figure 3 miR-381-3p对HA-VSMCs VC和凋亡的影响
通过微阵列分析，并推测NFAT5可能是mir-381-3p介导的钙化调控的靶基因。双荧光素酶报告基因实验进行了验证，得知miR-381-3p可以直接与NFAT5 mRNA的3'UTR序列结合。对转染了miR-381-3p模拟物的HA-VSMCs中NFAT5蛋白和mRNA表达水平进行了评估，模拟物下调NFAT5的蛋白和mRNA水平。在HA-VSMCs中应用BMSC-Exo后，NFAT5 mRNA和蛋白表达水平也是下调。表明，miR-381-3p通过直接靶向NFAT5 mRNA 3'UTR序列调控其表达。
Figure 4 MiR-381-3p通过直接靶向NFAT5的3'UTR抑制NFAT5
Si-NFAT5转染HA-VSMCs后，NFAT5的mRNA和蛋白表达显著降低，miR-381-3p的表达未受影响。钙沉积和凋亡相关指标检测，结果表明，NFAT5的下调抑制了高Pi诱导的细胞凋亡和钙化。MiR-381-3p模拟物(100nM)和人NFAT5过表达质粒(oe-NFAT5)共转染HA-VSMCs，检测共转染后凋亡和钙化情况，相关凋亡指标。oe-NFAT5显著加剧了细胞的凋亡和钙化，而oe-NFAT5大大减弱了miR-381-3p模拟物的抑制作用，表明NFAT5对于外泌体miR-381-3p的抗钙化和抗凋亡作用至关重要。
Figure 5 MiR-381-3p通过靶向NFAT5抑制凋亡和VC
4. BMSC-Exo对SNx大鼠细胞凋亡及VC的治疗作用
实验用5/6SNx大鼠建立稳定的VC模型。术后16周SNx组大鼠较SNx+Exo组和SHAM组大鼠明显变瘦。较SHAM组，SNx组Scr和BUN水平升高，BMSC-Exo处理后Scr和BUN水平降低。因此，BMSC-Exo延长了SNx大鼠的生命，并改善了肾功能。
SNx大鼠16周后，主动脉的茜素红S和Von Kossa (V-K)染色均呈阳性，SHAM组钙沉积少。定量了Ca2+含量和AKP活性，SNx后胸主动脉Ca2+含量和AKP活性明显升高，BMSC-Exo治疗可缓解上述变化。TUNEL检测胸主动脉细胞凋亡，SHAM组凋亡细胞较少，而SNx组大量凋亡细胞随血管介质分布，与钙沉积分布相似，BMSC-Exo处理后TUNEL阳性减少。RT-qPCR和Western blot显示BMSC-Exo降低了SNx引起的BAX和裂解的caspase3表达，增加了SNx引起的BCL-2的mRNA和蛋白水平，提示BMSC-Exo减轻了SNx诱导的胸主动脉细胞凋亡。
Figure 6 BMSC-Exo对5/6 SNx大鼠生存、肾功能、细胞凋亡及VC的治疗作用
5. 在体内，Exo-miR-381-3p/ NFAT5轴参与抗钙化作用
BMSC-Exo处理SNx大鼠，上调miR-381-3p，下调NFAT5的表达。验证Exo-miR-381-3p/NFAT5轴在透析患者中的作用，将其分为VC组和非VC组。TUNEL检测显示VC组血管介质中有大量凋亡细胞分布，RT-qPCR结果证实，nVC组血管组织中miR-381-3p的表达明显高于VC组，miR-381-3p可能对透析患者VC有保护作用。免疫组化显示VC组NFAT5阳性染色明显增加，NFAT5在VC中发挥了潜在的恶化作用。
Figure 7 BMSC-Exo通过调节miR-381-3p/NFAT5轴抑制5/6SNx大鼠胸主动脉的凋亡
总结：
研究发现BMSC-Exo通过传递miR-381-3p并抑制其靶基因NFAT5，进而抑制VSMCs的凋亡，从而发挥其抑制血管钙化的作用。不仅揭示了miR-381-3p/NFAT5在调控细胞凋亡/ VC中的重要作用，也拓展了对BMSC-Exo在CKD-VC等复杂机制疾病中的调控作用的认识。