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研载生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
一文带你了解如何实现锚肽捕获、靶向和装载各种来源的外泌体
3035 人阅读发布时间：2022-06-24 14:51
近年来，由于外泌体免疫原性低、生物相容度高、可携带多种生物大分子等优势，在疾病诊疗领域受到广泛重视和应用。装载和靶向患者来源的外泌体而不改变外泌体表面的能力是释放其治疗潜力的关键。天津医科大学的尹海芳教授团队使用噬菌体展示识别肽(CP05)，能够直接、有效地功能化和捕获外泌体，从而为外泌体工程、探测体内基因功能和靶向治疗药物输送提供了工具。相关研究成果发表在Science translational medicine上，IF：17.956。
技术路线：
研究结果：
1. CP05通过CD63特异性地绘制外泌体
小鼠肌管C2C12-外泌体与罗丹明标记的多肽孵育，形成复合物的荧光信号比单独罗丹明标记的肽亮，说明三种肽（CP05、CP06、CP07）都与外泌体相互作用。将外泌体与His标记的CP05-包被的、打乱的CP05-包被的或CP07-包被的珠子孵育，并用蛋白裂解缓冲液进行裂解，Western blot分析结合的蛋白。CP05样品中产生更强的CD63条带，说明CP05特异性结合CD63的亲和力更强。CP05与其他四胞素或外泌体标记物没有特异性的相互作用。表明了CP05通过CD63特异性结合外泌体。
2. CP05不改变外泌体的特征和体内分布
使用流式细胞术表征单个外泌体，检测到88.7%的DiR标记的外泌体(DiR-Exo)被罗丹明标记的CP05修饰，与DiR-Exo CD63表达丰度一致。通过小动物成像系统(IVIS)实时观察，静脉注射给药后，C57BL/6小鼠中DiR-Exo的组织分布未受CP05修饰的影响。外泌体固定的CP05在注射后4小时仍可检测到， AF680标记的CP05在注射后2小时消失，表明外泌体有保护CP05不被降解的能力。
3. 通过CP05绘制的靶向部分在体内重新分配外泌体
AF680标记的M12-CP05偶联物与DiR标记的外泌体(EXOM12)孵育2小时，静脉注射到C57BL/6小鼠，2小时后IVIS成像观察到EXOM12的小鼠外周肌肉的荧光强度增加，表明M12-CP05将外泌体作用于肌肉。神经元特异性狂犬病毒糖蛋白(RVG)多肽-CP05-Exo(EXORVG)在相同条件下将C2C12-Exo定向到大脑；肝细胞癌(HCC)靶向肽(SP94)-CP05-Exo(EXOSP94)将表达CD63的Hepa1-6外泌体定向到肿瘤。表明，CP05可以锚定外泌体上的靶向肽，并重定向外泌体的系统分布到特定的组织。罗丹明标记的多肽与DiR-Exo孵育，并定量分析过滤后的EXOM12、EXORVG和EXOSP94，三个样本修饰效率相似。罗丹明标记的CP05与表达CD63的人成肌细胞、肌管、宫颈癌(HeLa)细胞和肝细胞的外泌体孵育后的流式细胞仪分析显示，CP05可以有效地结合人外泌体。以上结果表明，CP05能够以肽/外泌体的比例有效地绘制CD63阳性的外泌体，而不考虑外泌体的来源。
4. CP05能从人血清中分离出外泌体
在镍免疫磁珠上使用His-CP05从人血清中捕获了相当数量的循环外泌体，CP05捕获的外泌体表现出典型的酱杯形状。CP05从HCC或胰腺癌患者血清中捕获的外泌体中检测到丰富的AFP或GPC1蛋白（肿瘤相关抗原），表明CP05具有有效分离外泌体的能力。
5. CP05允许外泌体的双重修饰
罗丹明标记的M12CP05和荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的NP41-CP05，分别或一起与外泌体孵育2小时，大多数外泌体同时标记了两种多肽，表明CP05可在外泌体上固定两种不同的部分。接着通过荧光共振能量转移(FRET)试验，经NP41-CP05和RVG-CP05修饰后的外泌体比混合使用单标记EXONP41和EXORVG时检测到更强的FRET信号，表明CP05可以修饰不同部分的单个外泌体，而且肽没有在EXONP41和EXORVG之间跳跃，相互作用稳定。
6. CP05指导外泌体上有效的PMO负载
CP05-PMO-Exo复合物(EXOPMO)的形态和大小未发生改变，结合效率为82.5%。mdx小鼠胫骨前肌局部肌内注射EXOPMO可导致大量肌营养不良蛋白阳性纤维，与PMO、单独CP05-PMO或PMO与外泌体混合在相同条件下相比，肌营养不良蛋白表达显著增加。表明CP05介导的外泌体传递可以改善肌肉中PMO的摄取。相比于在成年mdx小鼠中以每公斤12.5毫克的PMO单次注射EXOPMO，每周3次重复注射EXOPMO可诱导更多肌营养不良蛋白阳性纤维，并显著提高胫骨前肌、四头肌和三头肌外显子跳跃和肌营养不良蛋白恢复的效率。这些数据表明，cp05介导的外泌体锚定PMO可以增强PMO在mdx小鼠中的传递。
7. CP05能够将PMO定向输送到肌肉
M12-CP05和CP05-PMO与外泌体共孵育，每周静脉注射mdx小鼠，持续3周。肌肉靶向肽、PMO和外泌体(EXOPMO&M12)联合使用，与EXOPMO相比，在相同条件下，mdx治疗小鼠的四头肌、腓肠肌和三头肌中dystrophin阳性肌纤维的数量显著增加。与EXOPMO相比，EXOPMO&M12处理的外显子跳跃效率和肌营养不良蛋白的表达显著提高，表明CP05能够有针对性地有效向肌肉传递PMO。并且通过一些血清生化指标分析和炎症检查，都表明，CP05能够安全、有针对性地通过外泌体运送治疗性货物，是外泌体工程的一个有价值的工具。
总结：
本研究证明了通过外泌体锚定肽直接、有效地修饰、装载和捕获外泌体的概念，可以简化基因工程和装载外泌体的程序。该技术在其他疾病模型的研究和治疗中具有普遍应用价值。
技术路线：
1. CP05通过CD63特异性地绘制外泌体
小鼠肌管C2C12-外泌体与罗丹明标记的多肽孵育，形成复合物的荧光信号比单独罗丹明标记的肽亮，说明三种肽（CP05、CP06、CP07）都与外泌体相互作用。将外泌体与His标记的CP05-包被的、打乱的CP05-包被的或CP07-包被的珠子孵育，并用蛋白裂解缓冲液进行裂解，Western blot分析结合的蛋白。CP05样品中产生更强的CD63条带，说明CP05特异性结合CD63的亲和力更强。CP05与其他四胞素或外泌体标记物没有特异性的相互作用。表明了CP05通过CD63特异性结合外泌体。
2. CP05不改变外泌体的特征和体内分布
使用流式细胞术表征单个外泌体，检测到88.7%的DiR标记的外泌体(DiR-Exo)被罗丹明标记的CP05修饰，与DiR-Exo CD63表达丰度一致。通过小动物成像系统(IVIS)实时观察，静脉注射给药后，C57BL/6小鼠中DiR-Exo的组织分布未受CP05修饰的影响。外泌体固定的CP05在注射后4小时仍可检测到， AF680标记的CP05在注射后2小时消失，表明外泌体有保护CP05不被降解的能力。
AF680标记的M12-CP05偶联物与DiR标记的外泌体(EXOM12)孵育2小时，静脉注射到C57BL/6小鼠，2小时后IVIS成像观察到EXOM12的小鼠外周肌肉的荧光强度增加，表明M12-CP05将外泌体作用于肌肉。神经元特异性狂犬病毒糖蛋白(RVG)多肽-CP05-Exo(EXORVG)在相同条件下将C2C12-Exo定向到大脑；肝细胞癌(HCC)靶向肽(SP94)-CP05-Exo(EXOSP94)将表达CD63的Hepa1-6外泌体定向到肿瘤。表明，CP05可以锚定外泌体上的靶向肽，并重定向外泌体的系统分布到特定的组织。罗丹明标记的多肽与DiR-Exo孵育，并定量分析过滤后的EXOM12、EXORVG和EXOSP94，三个样本修饰效率相似。罗丹明标记的CP05与表达CD63的人成肌细胞、肌管、宫颈癌(HeLa)细胞和肝细胞的外泌体孵育后的流式细胞仪分析显示，CP05可以有效地结合人外泌体。以上结果表明，CP05能够以肽/外泌体的比例有效地绘制CD63阳性的外泌体，而不考虑外泌体的来源。
4. CP05能从人血清中分离出外泌体
在镍免疫磁珠上使用His-CP05从人血清中捕获了相当数量的循环外泌体，CP05捕获的外泌体表现出典型的酱杯形状。CP05从HCC或胰腺癌患者血清中捕获的外泌体中检测到丰富的AFP或GPC1蛋白（肿瘤相关抗原），表明CP05具有有效分离外泌体的能力。
5. CP05允许外泌体的双重修饰
罗丹明标记的M12CP05和荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记的NP41-CP05，分别或一起与外泌体孵育2小时，大多数外泌体同时标记了两种多肽，表明CP05可在外泌体上固定两种不同的部分。接着通过荧光共振能量转移(FRET)试验，经NP41-CP05和RVG-CP05修饰后的外泌体比混合使用单标记EXONP41和EXORVG时检测到更强的FRET信号，表明CP05可以修饰不同部分的单个外泌体，而且肽没有在EXONP41和EXORVG之间跳跃，相互作用稳定。
6. CP05指导外泌体上有效的PMO负载
CP05-PMO-Exo复合物(EXOPMO)的形态和大小未发生改变，结合效率为82.5%。mdx小鼠胫骨前肌局部肌内注射EXOPMO可导致大量肌营养不良蛋白阳性纤维，与PMO、单独CP05-PMO或PMO与外泌体混合在相同条件下相比，肌营养不良蛋白表达显著增加。表明CP05介导的外泌体传递可以改善肌肉中PMO的摄取。相比于在成年mdx小鼠中以每公斤12.5毫克的PMO单次注射EXOPMO，每周3次重复注射EXOPMO可诱导更多肌营养不良蛋白阳性纤维，并显著提高胫骨前肌、四头肌和三头肌外显子跳跃和肌营养不良蛋白恢复的效率。这些数据表明，cp05介导的外泌体锚定PMO可以增强PMO在mdx小鼠中的传递。
7. CP05能够将PMO定向输送到肌肉
M12-CP05和CP05-PMO与外泌体共孵育，每周静脉注射mdx小鼠，持续3周。肌肉靶向肽、PMO和外泌体(EXOPMO&M12)联合使用，与EXOPMO相比，在相同条件下，mdx治疗小鼠的四头肌、腓肠肌和三头肌中dystrophin阳性肌纤维的数量显著增加。与EXOPMO相比，EXOPMO&M12处理的外显子跳跃效率和肌营养不良蛋白的表达显著提高，表明CP05能够有针对性地有效向肌肉传递PMO。并且通过一些血清生化指标分析和炎症检查，都表明，CP05能够安全、有针对性地通过外泌体运送治疗性货物，是外泌体工程的一个有价值的工具。
总结：
本研究证明了通过外泌体锚定肽直接、有效地修饰、装载和捕获外泌体的概念，可以简化基因工程和装载外泌体的程序。该技术在其他疾病模型的研究和治疗中具有普遍应用价值。