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公司新闻/正文
热点思路：炎症小体-自噬-外泌体途径激活细胞焦亡诱导皮肤损伤，轻松拿捏高分文章！
3906 人阅读发布时间：2022-07-22 17:44
氧化锌纳米粒子(ZnONPs)因具有美白和紫外吸收能力而被用于化妆品中，但ZnONPs被皮肤吸收后引起毒性的安全问题及危害尚不清楚。激活NLRP3可引发一种快速、炎症性的细胞程序性死亡形式—细胞焦亡，但ZnONPs诱导的角质细胞死亡是否与细胞焦亡有关仍未知。此外多种纳米材料的毒性途径是诱导细胞自噬功能障碍，导致受损细胞器积累并增强ROS产生和NLRP3复合物组装。外泌体(EV)可能会在炎症小体和自噬之间的串扰过程中起到桥梁作用。因此台湾国立成功大学的研究者们探究了UVB和ZnONPs对皮肤损伤的潜在机制，及具有抗氧化和抗炎作用的紫檀芪(PT)对皮肤损伤的治疗效果，并将成果发表在Particle and Fibre Toxicology(IF:9.306)杂志上。
技术路线：
实验结果：
1. ZnONPs的物理化学性质及其细胞毒性
为最大限度地减少纳米粒子的聚集、离子脱落效应和自由基的形成等，作者用胺修饰了ZnONPs颗粒，对其物化性质进行分析。
被修饰的ZnONPs成功被HaCaT细胞吸收，但如下图结果所示，在ZnONPs和UVB联合处理HaCaT细胞后，细胞形态呈现肿胀和球形，ZnONPs以剂量和时间依赖性对细胞产生毒性，而PT能显著保护HaCaT细胞免受ZnONPs和UVB的影响。
2. ZnONPs和UVB诱导的线粒体损伤激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡
上图TEM结果显示ZnONPs处理细胞后，线粒体损伤严重，外膜肿胀，脊退化。ZnONPs和UVB联合处理细胞3hr即可增加mtROS和总ROS的水平；处理24hr后，线粒体膜电位MMP显著下降，而PT可以抑制mtROS和总ROS的增加和MMP的降低。
WB结果显示NLRP3、ASC和裂解的caspase-1在ZnONPs和UVB的处理下表达增加，说明NLRP3炎症小体被激活。基于caspase-1 被激活，猜测可能发生了细胞焦亡，因此作者以凋亡诱导剂星形孢菌素(STS)为阴性对照进行分析，ZnONPs和UVB组细胞LDH的释放和PI信号显著增加，焦亡标志蛋白pro-GSDMD和GSDMD-NT表达增加。炎症小体和细胞焦亡蛋白的增加可被PT逆转。将caspase-1敲除后，ZnONPs和UVB作用下的细胞死亡减少，焦亡相关蛋白亦有所降低。表明ZnONPs和UVB激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡，PT能减弱ZnONPs和UVB对细胞的影响。
3. ROS在ZnONPs和UVB诱导的NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡中起重要作用
与ZnONPs和UVB处理组相比，联合使用ROS抑制剂NAC处理3hr细胞能显著降低细胞内ROS、LDH的水平，并减轻细胞死亡。NAC与ZnONPs和UVB联合处理细胞后，能降低细胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1和GSDMD的表达。表明ROS在ZnONPs和UVB激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡中起关键作用。
4. PT抑制ZnONPs和UVB触发的自噬功能障碍
自噬激活可通过细胞内降解系统限制NLRP3炎症小体激活，而自噬功能障碍是纳米材料对细胞的早期作用。从上述的TEM图中可以看出ZnONPs处理细胞后出现大量含ZnONPs的自噬体。用吖啶橙(AO)评估自噬通量，发现随着ZnONPs和UVB处理，细胞内AO荧光水平增加，PT的存在抑制AO荧光强度。在ZnONPs和UVB处理后自噬通量蛋白LC3-II和p62的表达增加。双荧光染色各处理组溶酶体标记LAMP-1和自噬体标记LC3-II，发现ZnONPs和UVB处理组溶酶体和自噬体无法融合，PT组融合成功。表明ZnONPs和UVB能诱导自噬功能障碍，而PT恢复了受阻的自噬通量。
5. EV介导ZnONPs和UVB诱导NLRP3炎症小体成分在细胞间传递
据研究表明细胞间可通过EV携带NLRP3炎症小体蛋白而相互影响。因此作者从ZnONPs和UVB处理的细胞培养液中分离出EV，WB显示EV载有NLRP3炎症小体蛋白NLRP3、caspase-1和GSDMD。用来自ZnONPs和UVB处理的细胞EV处理HaCaT细胞后能增加细胞内NLRP3、caspase-1和GSDMD的蛋白水平。若用0.1%Triton X-100预处理EV后再处理细胞，则观察不到NLRP3、caspase-1和GSDMD的蛋白水平增加。表明ZnONPs和UVB可诱导NLRP3炎症小体和细胞焦亡蛋白通过EV在细胞间传递，从而进一步传播炎症和细胞焦亡。
6. 细胞中自噬功能障碍促进了EV释放
自噬诱导剂雷帕霉素与ZnONPs和UVB联合处理细胞能降低EV负载炎症小体蛋白和焦亡蛋白，用自噬抑制剂氯喹CQ阻断自噬通量时，携带炎症小体蛋白和焦亡蛋白的EV增加。建立Transwell共培养系统，上室的HaCaT用DioC18染色后与下室未染色HaCaT细胞共培养，如上图所示，ZnONPs和UVB处理上室细胞后的EV可被下室细胞摄取，雷帕霉素的存在能下调EV释放，而CQ显著增加EV释放。表明自噬功能障碍可以促进ZnONPs和UVB诱导的EV释放。
7. 在小鼠皮肤模型中PT抑制ZnONPs和UVB诱导的NLRP3炎症小体和caspase-1活化
暴露于UVB照射和ZnONPs处理的SKH-1无毛小鼠皮肤发红、真皮肿胀、起皱、增生，且真皮水分流失，在UVB照射和ZnONPs处理后局部使用PT乳膏进行治疗，可以减轻皮肤增厚、发红和水平流失。皮肤组织中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和GSDMD的表达在ZnONPs和UVB处理组增加，说明UVB和ZnONPs共同处理小鼠皮肤会诱导急性皮肤损伤，激活NLRP3炎症小体，并诱导皮肤细胞焦亡，PT局部治疗通过抑制NLRP3炎症小体减轻UVB和ZnONPs引发的皮肤炎症和损伤。
讨论：
本研究作者确定了UVB和ZnONPs的对角质形成细胞的影响：皮肤表面损伤；增强ROS生成；促进线粒体损伤和mROS释放；激活NLRP3炎症小体，诱导细胞焦亡；诱导自噬功能障碍；促进EV释放。首次证明了UVB和ZnONPs诱导的炎症可以通过自噬途径的EV释放来调节的。同时验证了PT可通过调节炎症小体-自噬-EV途径来减轻皮肤损伤。该研究为进一步评估化妆品中ZnONPs对皮肤的影响提供参考。
实验结果：
1. ZnONPs的物理化学性质及其细胞毒性
为最大限度地减少纳米粒子的聚集、离子脱落效应和自由基的形成等，作者用胺修饰了ZnONPs颗粒，对其物化性质进行分析。
被修饰的ZnONPs成功被HaCaT细胞吸收，但如下图结果所示，在ZnONPs和UVB联合处理HaCaT细胞后，细胞形态呈现肿胀和球形，ZnONPs以剂量和时间依赖性对细胞产生毒性，而PT能显著保护HaCaT细胞免受ZnONPs和UVB的影响。
2. ZnONPs和UVB诱导的线粒体损伤激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡
上图TEM结果显示ZnONPs处理细胞后，线粒体损伤严重，外膜肿胀，脊退化。ZnONPs和UVB联合处理细胞3hr即可增加mtROS和总ROS的水平；处理24hr后，线粒体膜电位MMP显著下降，而PT可以抑制mtROS和总ROS的增加和MMP的降低。
WB结果显示NLRP3、ASC和裂解的caspase-1在ZnONPs和UVB的处理下表达增加，说明NLRP3炎症小体被激活。基于caspase-1 被激活，猜测可能发生了细胞焦亡，因此作者以凋亡诱导剂星形孢菌素(STS)为阴性对照进行分析，ZnONPs和UVB组细胞LDH的释放和PI信号显著增加，焦亡标志蛋白pro-GSDMD和GSDMD-NT表达增加。炎症小体和细胞焦亡蛋白的增加可被PT逆转。将caspase-1敲除后，ZnONPs和UVB作用下的细胞死亡减少，焦亡相关蛋白亦有所降低。表明ZnONPs和UVB激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡，PT能减弱ZnONPs和UVB对细胞的影响。
3. ROS在ZnONPs和UVB诱导的NLRP3炎症小体激活和细胞焦亡中起重要作用
与ZnONPs和UVB处理组相比，联合使用ROS抑制剂NAC处理3hr细胞能显著降低细胞内ROS、LDH的水平，并减轻细胞死亡。NAC与ZnONPs和UVB联合处理细胞后，能降低细胞中NLRP3、ASC、pro-caspase-1、cleaved caspase-1和GSDMD的表达。表明ROS在ZnONPs和UVB激活NLRP3炎症小体和细胞焦亡中起关键作用。
4. PT抑制ZnONPs和UVB触发的自噬功能障碍
自噬激活可通过细胞内降解系统限制NLRP3炎症小体激活，而自噬功能障碍是纳米材料对细胞的早期作用。从上述的TEM图中可以看出ZnONPs处理细胞后出现大量含ZnONPs的自噬体。用吖啶橙(AO)评估自噬通量，发现随着ZnONPs和UVB处理，细胞内AO荧光水平增加，PT的存在抑制AO荧光强度。在ZnONPs和UVB处理后自噬通量蛋白LC3-II和p62的表达增加。双荧光染色各处理组溶酶体标记LAMP-1和自噬体标记LC3-II，发现ZnONPs和UVB处理组溶酶体和自噬体无法融合，PT组融合成功。表明ZnONPs和UVB能诱导自噬功能障碍，而PT恢复了受阻的自噬通量。
5. EV介导ZnONPs和UVB诱导NLRP3炎症小体成分在细胞间传递
据研究表明细胞间可通过EV携带NLRP3炎症小体蛋白而相互影响。因此作者从ZnONPs和UVB处理的细胞培养液中分离出EV，WB显示EV载有NLRP3炎症小体蛋白NLRP3、caspase-1和GSDMD。用来自ZnONPs和UVB处理的细胞EV处理HaCaT细胞后能增加细胞内NLRP3、caspase-1和GSDMD的蛋白水平。若用0.1%Triton X-100预处理EV后再处理细胞，则观察不到NLRP3、caspase-1和GSDMD的蛋白水平增加。表明ZnONPs和UVB可诱导NLRP3炎症小体和细胞焦亡蛋白通过EV在细胞间传递，从而进一步传播炎症和细胞焦亡。
6. 细胞中自噬功能障碍促进了EV释放
自噬诱导剂雷帕霉素与ZnONPs和UVB联合处理细胞能降低EV负载炎症小体蛋白和焦亡蛋白，用自噬抑制剂氯喹CQ阻断自噬通量时，携带炎症小体蛋白和焦亡蛋白的EV增加。建立Transwell共培养系统，上室的HaCaT用DioC18染色后与下室未染色HaCaT细胞共培养，如上图所示，ZnONPs和UVB处理上室细胞后的EV可被下室细胞摄取，雷帕霉素的存在能下调EV释放，而CQ显著增加EV释放。表明自噬功能障碍可以促进ZnONPs和UVB诱导的EV释放。
7. 在小鼠皮肤模型中PT抑制ZnONPs和UVB诱导的NLRP3炎症小体和caspase-1活化
暴露于UVB照射和ZnONPs处理的SKH-1无毛小鼠皮肤发红、真皮肿胀、起皱、增生，且真皮水分流失，在UVB照射和ZnONPs处理后局部使用PT乳膏进行治疗，可以减轻皮肤增厚、发红和水平流失。皮肤组织中NLRP3、ASC、cleaved caspase-1和GSDMD的表达在ZnONPs和UVB处理组增加，说明UVB和ZnONPs共同处理小鼠皮肤会诱导急性皮肤损伤，激活NLRP3炎症小体，并诱导皮肤细胞焦亡，PT局部治疗通过抑制NLRP3炎症小体减轻UVB和ZnONPs引发的皮肤炎症和损伤。
讨论：
本研究作者确定了UVB和ZnONPs的对角质形成细胞的影响：皮肤表面损伤；增强ROS生成；促进线粒体损伤和mROS释放；激活NLRP3炎症小体，诱导细胞焦亡；诱导自噬功能障碍；促进EV释放。首次证明了UVB和ZnONPs诱导的炎症可以通过自噬途径的EV释放来调节的。同时验证了PT可通过调节炎症小体-自噬-EV途径来减轻皮肤损伤。该研究为进一步评估化妆品中ZnONPs对皮肤的影响提供参考。