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研载生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
关于circRNA研究的疑问，你知道吗？
1924 人阅读发布时间：2023-04-11 13:57
1.怎么提取和逆转录circRNA ?
常用细胞组织等样品提取total RNA，其中包含mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA等所有的RNA种类，目前没有直接提取circRNA的方法。但可以对total RNA进行RNase R消化处理，以使circRNA得到富集。
对total RNA或RNase R处理的RNA进行逆转录，应使用随机引物，不能使用oligo(dT)，因为circRNA没有polyA尾。逆转录过程中circRNA模板是呈环形的，逆转录的cDNA第一链是线性的单链DNA，后续的PCR产物是线性的双链DNA。
2.高通量测序得到的circRNA怎么验证？
高通量测序等方法筛选得到的circRNAPCR检测、circRNA全长鉴定和RNase R消化实验等进一步验证。
3.circRNA过表达怎么做？
CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体来进行。
已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
具体实验中构建载体时可以在circRNA的侧翼各延伸1kb（一般会包含Alu或重复序列），使用真核表达载体构建一个上游侧翼1kb+circRNA+下游侧翼1kb的载体，一般都可以成功地过表达构建的circRNA。另外也可以使用商业化有通用成环框架的circRNA表达载体（如pLCDH-ciR）来构建，只需要连接circRNA序列进入载体即可。
4.circRNA过表达成功标准？
载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。
1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；
2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。
5.怎么查找circRNA侧翼的Alu元件？
Alu元件在RepeatMasker中有注释，在UCSC Genome Browser可以根据基因组位置查找circRNA侧翼的Alu元件。
图为hsa_circ_0006404在基因组上的位置，红色箭头处可以手动输入以调整上下游延伸的长度，绿色箭头指示SINE行中即为可能存在的Alu元件（或其他重复元件），点击灰框进去可以查看详细的注释信息和序列。
6.circRNA 的沉默（干扰）怎么做？
基于RNAi技术对基因进行沉默，实验中一般设计合成靶标基因的siRNA，瞬转细胞后进行RT-PCR检测。
外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列，在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性，因此只能针对junction位点处设计靶标序列，前后移动范围有限，siRNA通常很难设计。
EiciRNA或者内含子来源的环形RNA，除了针对junction位点处设计靶标外，也可以尝试在内含子序列上设计。
circRNA的siRNA设计示意图
7.CRISPR/Cas9可以用来做circRNA敲除吗？
CRISPR/Cas9利用gRNA引导靶标DNA来实现对特定位置的切割，能快速高效地对基因进行敲除或编辑。
以基因组DNA上特定位置为模板转录可能同时形成mRNA或circRNA等，若以CRISPR/Cas9对基因组DNA特定位置进行敲除，除了敲除circRNA外，也可能造成mRNA被敲除，因此直接用 CRISPR/Cas9敲除circRNA而不影响对应的mRNA几乎无法实现。另外考虑circRNA侧翼的Alu元件，敲除位置（gRNA靶标位置）的设计选择也有很大局限性。只有几种特殊的情况可以用CRISPR/Cas9来敲除circRNA。
一种情况是直接敲除circRNA的成熟序列来源。例如来源于X染色体的Cdr1as表达不是性别特异的，也检测不到同一位置来源的其他RNA表达，因此可以直接敲除Cdr1as的成熟序列对应的gDNA区域。
小鼠Cdr1as敲除
一种情况是敲除circRNA侧翼的Alu元件。例如circHIPK3有特别长的flanking introns，敲除侧翼的Alu元件后不影响对应的mRNA表达，这种敲除也是成功的。但大多数circRNA侧翼的Alu元件都不止一个，靶标敲除哪一个Alu，会不会影响mRNA或其他线性RNA的表达，在实验设计时都很难确定。
敲除circHIPK3侧翼的Alu元件
另外一种策略，靶标同一段DNA，使circRNA和对应的mRNA都被敲除，然后再恢复mRNA，间接实现敲除circRNA而不影响对应的mRNA。
8.怎么验证circRNA的miRNA sponge功能？
CircRNA作为miRNA的sponge，其核心依据是circRNA的序列可以和miRNA结合，可以利用体外的双荧光素酶实验来验证。一般将circRNA的序列连接到psiCHECK2载体上，将载体和miRNA mimics同时转染细胞，之后检测荧光素酶活性可以判断circRNA序列和miRNA的结合情况。
另外也可以进行FISH实验，分别以荧光探针标记circRNA和miRNA，若circRNA和miRNA有共定位的情况，推测circRNA和miRNA可能有结合。
9.circRNA为什么要做RNase R消化？
RNase R是一种核糖酸外切酶，可以消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。
CircRNA具有闭合环状结构，因此不易被核酸外切酶降解，使用RNase R消化RNA，可以用来证明circRNA耐受消化，也可以对circRNA进行富集。RNase R消化是鉴定和验证circRNA必不可少的一个实验。
10.怎么知道一个circRNA是否可以翻译蛋白？
CircRNA翻译蛋白是一个新的热门研究方向，但受限于分析和验证方法及其难度，目前仅有不到10篇文章报道。
考虑感兴趣的circRNA是否能翻译蛋白，可先以ORF Finder分析序列基础，预测是否有合适的ORF。有一个跨越junction的ORF是最理想的，序列内部不跨越junction的ORF可能和mRNA一样，没办法特异研究circRNA。也可以参考circRNADb数据库，已收录的circRNA都有相应的ORF注释信息。
有了序列基础后也要考虑circRNA翻译的机制，如考虑IRES介导可以在circRNADb参考相应的预测信息，或者使用其他工具预测IRES元件，也可以考虑m6A介导的翻译。
预测ORF有了序列基础，再分析IRES和m6A或其他机制介导翻译，下一步就可以进行实验验证了。实验可以分为两部分，一是用特异性的抗体或引入标签抗体进行检测，验证是否能检测到预测的蛋白（多肽），二是验证IRES或m6A介导的翻译机制。
常用细胞组织等样品提取total RNA，其中包含mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA等所有的RNA种类，目前没有直接提取circRNA的方法。但可以对total RNA进行RNase R消化处理，以使circRNA得到富集。
对total RNA或RNase R处理的RNA进行逆转录，应使用随机引物，不能使用oligo(dT)，因为circRNA没有polyA尾。逆转录过程中circRNA模板是呈环形的，逆转录的cDNA第一链是线性的单链DNA，后续的PCR产物是线性的双链DNA。
2.高通量测序得到的circRNA怎么验证？
高通量测序等方法筛选得到的circRNAPCR检测、circRNA全长鉴定和RNase R消化实验等进一步验证。
3.circRNA过表达怎么做？
CircRNA的形成和线性RNA不同，因此对circRNA的过表达不能直接将序列连接到常规的真核表达载体来进行。
已明确的circRNA形成依赖于侧翼序列中的反向互补序列（RCMs，如Alu元件）或与能调控circRNA生成的蛋白（如QKI）的结合位点，因此构建载体时可以在circRNA序列上下游分别增加一段反向互补的序列，质粒转染细胞后会先转录出上游+circRNA+下游的线性RNA链，再依靠长下游的反向互补配对促使成环。
具体实验中构建载体时可以在circRNA的侧翼各延伸1kb（一般会包含Alu或重复序列），使用真核表达载体构建一个上游侧翼1kb+circRNA+下游侧翼1kb的载体，一般都可以成功地过表达构建的circRNA。另外也可以使用商业化有通用成环框架的circRNA表达载体（如pLCDH-ciR）来构建，只需要连接circRNA序列进入载体即可。
4.circRNA过表达成功标准？
载体构建好后瞬时转染细胞进行RT-PCR检测以验证过表达效率。
1）qPCR检测有过表达倍数，质粒瞬转效率高，基因本底丰度不太高的话一般都可以过表达50倍以上；
2）使用Divergent引物检测过表达的PCR产物是大小正确的单一条带，PCR产物进行sanger测序确定成环序列准确。满足这两个条件才可以认为载体实现了对circRNA的准确高效率过表达。
5.怎么查找circRNA侧翼的Alu元件？
Alu元件在RepeatMasker中有注释，在UCSC Genome Browser可以根据基因组位置查找circRNA侧翼的Alu元件。
图为hsa_circ_0006404在基因组上的位置，红色箭头处可以手动输入以调整上下游延伸的长度，绿色箭头指示SINE行中即为可能存在的Alu元件（或其他重复元件），点击灰框进去可以查看详细的注释信息和序列。
6.circRNA 的沉默（干扰）怎么做？
基于RNAi技术对基因进行沉默，实验中一般设计合成靶标基因的siRNA，瞬转细胞后进行RT-PCR检测。
外显子来源的circRNA因为和mRNA有同样的外显子序列，在序列内部设计siRNA靶标无法保证特异性，因此只能针对junction位点处设计靶标序列，前后移动范围有限，siRNA通常很难设计。
EiciRNA或者内含子来源的环形RNA，除了针对junction位点处设计靶标外，也可以尝试在内含子序列上设计。
circRNA的siRNA设计示意图
7.CRISPR/Cas9可以用来做circRNA敲除吗？
CRISPR/Cas9利用gRNA引导靶标DNA来实现对特定位置的切割，能快速高效地对基因进行敲除或编辑。
以基因组DNA上特定位置为模板转录可能同时形成mRNA或circRNA等，若以CRISPR/Cas9对基因组DNA特定位置进行敲除，除了敲除circRNA外，也可能造成mRNA被敲除，因此直接用 CRISPR/Cas9敲除circRNA而不影响对应的mRNA几乎无法实现。另外考虑circRNA侧翼的Alu元件，敲除位置（gRNA靶标位置）的设计选择也有很大局限性。只有几种特殊的情况可以用CRISPR/Cas9来敲除circRNA。
一种情况是直接敲除circRNA的成熟序列来源。例如来源于X染色体的Cdr1as表达不是性别特异的，也检测不到同一位置来源的其他RNA表达，因此可以直接敲除Cdr1as的成熟序列对应的gDNA区域。
小鼠Cdr1as敲除
一种情况是敲除circRNA侧翼的Alu元件。例如circHIPK3有特别长的flanking introns，敲除侧翼的Alu元件后不影响对应的mRNA表达，这种敲除也是成功的。但大多数circRNA侧翼的Alu元件都不止一个，靶标敲除哪一个Alu，会不会影响mRNA或其他线性RNA的表达，在实验设计时都很难确定。
敲除circHIPK3侧翼的Alu元件
另外一种策略，靶标同一段DNA，使circRNA和对应的mRNA都被敲除，然后再恢复mRNA，间接实现敲除circRNA而不影响对应的mRNA。
8.怎么验证circRNA的miRNA sponge功能？
CircRNA作为miRNA的sponge，其核心依据是circRNA的序列可以和miRNA结合，可以利用体外的双荧光素酶实验来验证。一般将circRNA的序列连接到psiCHECK2载体上，将载体和miRNA mimics同时转染细胞，之后检测荧光素酶活性可以判断circRNA序列和miRNA的结合情况。
另外也可以进行FISH实验，分别以荧光探针标记circRNA和miRNA，若circRNA和miRNA有共定位的情况，推测circRNA和miRNA可能有结合。
9.circRNA为什么要做RNase R消化？
RNase R是一种核糖酸外切酶，可以消化几乎所有的线性RNA分子，但不易消化环形RNA、套索结构或3’突出末端少于7个核苷酸的双链RNA分子。
CircRNA具有闭合环状结构，因此不易被核酸外切酶降解，使用RNase R消化RNA，可以用来证明circRNA耐受消化，也可以对circRNA进行富集。RNase R消化是鉴定和验证circRNA必不可少的一个实验。
10.怎么知道一个circRNA是否可以翻译蛋白？
CircRNA翻译蛋白是一个新的热门研究方向，但受限于分析和验证方法及其难度，目前仅有不到10篇文章报道。
考虑感兴趣的circRNA是否能翻译蛋白，可先以ORF Finder分析序列基础，预测是否有合适的ORF。有一个跨越junction的ORF是最理想的，序列内部不跨越junction的ORF可能和mRNA一样，没办法特异研究circRNA。也可以参考circRNADb数据库，已收录的circRNA都有相应的ORF注释信息。
有了序列基础后也要考虑circRNA翻译的机制，如考虑IRES介导可以在circRNADb参考相应的预测信息，或者使用其他工具预测IRES元件，也可以考虑m6A介导的翻译。
预测ORF有了序列基础，再分析IRES和m6A或其他机制介导翻译，下一步就可以进行实验验证了。实验可以分为两部分，一是用特异性的抗体或引入标签抗体进行检测，验证是否能检测到预测的蛋白（多肽），二是验证IRES或m6A介导的翻译机制。