外泌体研究技术——提取鉴定篇

一、外泌体是什么？

   外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-150 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞(免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。区别于微囊泡（100-1000nm),凋亡小体（400-4000nm）。

 

   外泌体的功能：细胞增值与凋亡调控，转移与侵袭，血管生成，免疫应答，细胞分化，代谢调控，微生物组调控，病毒感染。

 

 

二、外泌体提取方式及优缺点

   外泌体提取方法主要有：差速离心、密度梯度离心、磁珠免疫、超滤法、聚合物沉淀方法、分子排阻法。如下图所示

 

 

   研载生物科技（上海）有限公司采取超速离心（差速离心）分离得到外泌体，可处理细胞上清，血清、血浆、尿液、体液、植物，组织等不同类型样本，纯度高，得率大，满足于后续不同实验的需求。

 

三、外泌体鉴定方式

   想获得高质量的外泌体并不容易，一是外泌体中可能混有杂质，二是分离纯化过程中的一系列操作可能破坏外泌体的结构，这都会对后续试验造成影响。为了保证研究的严谨性，对外泌体表征鉴定是很有必要的，一般鉴定外泌体要从大小、形态、表面标志物三个方面来进行。

   1. 外泌体浓度、大小

   纳米颗粒跟踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,即 NTA)技术，通过纳米颗粒示踪分析(Nanoparticle Tracking Analysis,即 NTA)技术， 可以对10-2000nm范围内的纳米颗粒进行快速实时动态检测，测量 参数包括颗粒粒径、散射光强、浓度等，可对抽提获得的外泌体进行粒 径大小及数量进行统计，以及初步质量评估。该技术易用、快速、稳健、 准确,是对现有外泌体鉴定方法的一个良好补充。我司采用的是马尔文NS300.

 

   

   2. 外泌体形态——透射电镜（TEM）

   透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，简称TEM)，可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构。双层囊膜结构（亚显微结构）是外泌体重要标志之一，所以透射电镜作为外泌体表征检测方式之一，可以很好的拍出外泌体双层囊膜结构，用来观察外泌体形态。

 

   

   3.外泌体表面标志物——蛋白质印迹法（Western Blot）

   蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

通过提取外泌体总蛋白，用Western Blot方法对目的蛋白进行相对定 量，了解其在外泌体中的富集情况，或通过特有外泌体标志物的 Western Blot鉴定说明样本为外泌体。

WB鉴定外泌体常见指标：CD63/ CD81/ CD9/ TGS101/ HSP70 /Alix等，针对外泌体的定性检测，至少选择2-3个指标就能满足文章发表就可以。大部分文献中没有检测内参，个别文章中使用了Actin、GAPDH和Tubulin作为内参进行检测，外泌体中的Actin、GAPDH和Tubulin的表达丰度相对于正常细胞样品中的较低，可能会检测不到任何条带或者条带微弱。