【MedComm】 9.9分，M1巨噬细胞来源外泌体通过向肝细胞转移LncRNA H19促进自身免疫性肝损伤

自身免疫性肝炎(AIH)是一种病因不明的慢性免疫细胞介导的肝脏疾病。尽管肝细胞凋亡在AIH进展中起关键作用，但细胞死亡调控的确切机制仍知之甚少。刀豆蛋白A (ConA)已被广泛认为是免疫介导的小鼠肝损伤的合适模型。湾湾今天分享的是发表在【MedComm】上题为“M1 macrophage‐derived exosomes promote autoimmune liver injury by transferring long noncoding RNA H19 to hepatocytes”的文章，本研究中，作者旨在研究lncRNA H19和外泌体是否在ConA诱导的肝炎中起关键作用。研究中作者发现在ConA治疗后肝脏中H19和外泌体的水平升高。外泌体抑制剂GW4869抑制H19的上调。H19主要在M1中表达。更重要的是，作者发现H19通过外泌体从M1转运到肝细胞，并激活HIF - 1α-p53信号通路，从而导致肝细胞凋亡。作者的研究结果揭示了巨噬细胞在AIH中的作用，表明M1来源的外泌体H19参与AIH，可能是AIH的新靶点。

 

研究结果

 

1.lncRNA H19和外泌体在ConA诱导的肝炎中均升高

图1A：肝组织切片代表性H&E染色，虚线为坏死区域。

图1B：注射ConA后血清ALT、AST水平。

图1C：采用RT - PCR方法分析不同组织中H19 mRNA水平。

图1D：肝脏中靶向H19的原位杂交（FISH）代表图像，H19确实存在于肝细胞中，在胚胎肝脏中高表达，而在成人肝脏中表达水平较低。

图1E：Western blot检测注射ConA的小鼠肝脏中CD63和凋亡蛋白（CC3、BAX和p53）的表达水平。

图1F：TUNEL染色结果显示ConA‐处理小鼠的TUNEL阳性细胞和凋亡蛋白的数量有所增加。

 

2.肝脏特异性过表达H19加重ConA诱导肝炎

图2A：小鼠在ConA治疗前经尾静脉注射AAV并处死。

图2B-C：H19表达的FISH代表性图像和RT - PCR结果显示，与用AAV- H19载体处理的对照组相比，用AAV - H19载体递送的小鼠肝脏中H19的表达显著增加。

图2D：致死剂量ConA处理后AAV-H19小鼠和AAV -载体对照小鼠的存活率，结果显示AAV-H19小鼠有更高的死亡率，表明AAV-H19小鼠更容易感染ConA诱导的肝炎。

图2E-F：肝损伤的代表性图像（E）和注射AAV- Vector或AAV- H19的ConA处理小鼠的血清ALT和AST水平（F）。

图2G：TUNEL染色显示肝脏内肝细胞凋亡。

图2H：Western blot检测肝组织中凋亡蛋白的表达，H19‐过表达的肝脏显著增加的肝细胞凋亡水平。

图2I：RT-PCR结果显示炎症标志物IL-6、TNF-α和IFN-γ表达水平升高。

 

3.外泌体抑制剂GW4869可减轻ConA诱导的肝炎

图3A：GW4869对ConA诱导肝损伤作用的实验过程示意图。

图3B：免疫组化结果显示CD63水平显著下降，表明肝脏外泌体被成功地耗尽。

图3C-D：组织学肝损伤的代表性图像（C）和RT-PCR检测是否注射GW4869的ConA后血清ALT和AST水平（D），结果表明GW4869显著改善了ConA诱导的肝损伤。

图3E-F：RT-PCR分析含或不含GW4869的ConA小鼠肝脏和肝细胞的H19水平，结果表明GW4869治疗降低了ConA处理的肝脏(E)和肝细胞(F)中H19的上调，这与对照组相当。

图3G：TUNEL染色结果显示，GW4869处理降低了ConA处理小鼠肝脏中的TUNEL阳性数量。

图3H：RT-PCR检测炎症标志物IL-6、TNF-α和IFN-γ表达水平，结果表明GW4869处理降低了ConA处理小鼠肝脏中的炎症细胞因子水平。

 

4.H19主要在M1巨噬细胞中表达

图4A：RT‐PCR结果显示，从ConA处理小鼠肝脏中分离的MNCs的H19发生了倍数变化。

图4B：流式细胞术分析ConA处理小鼠MNCs中F4/80+，结果显示，ConA处理小鼠MNCs中F4/80+细胞百分比增加。

图4C： ConA处理1 h后肝脏中F4/80(红色)和H19(绿色)的共定位，获得了巨噬细胞特异性标记物F4/80。

图4D-E：流式细胞术分析ConA处理小鼠单核细胞F4/80+CD11C+和F4/80+CD206+，结果显示注射ConA后1 h CD11c+F4/80+百分比增加，而CD206+F4/80+百分比未增加。

图4F：RT-PCR检测损伤肝脏NK细胞、T细胞和巨噬细胞中H19的表达水平，结果表明H19主要在CD11c+F4/80+中表达，在T细胞、NK细胞和CD11c−F4/80+中的表达水平相对较低。

图4G-H：用IFN-γ和 LPS同时刺激RAW264.7巨噬细胞和THP-1细胞24 H后，通过RT-PCR检测，结果显示H19在小鼠RAW246.7巨噬细胞和人THP‐1中扩增。

图4I：通过RT-PCR检测MNCs用或不用Clodronate liposomes处理ConA后 1小时的肝脏中H19水平。

图4J：通过RT- PCR 检测小鼠在用活不用Clodronate liposomes处理ConA后6小时的肝脏中H19水平。

图4K：ConA处理1小时后肝脏中F4/80(红色)和CD63(粉红色)的共定位，结果显示巨噬细胞的外泌体分泌CD63显著增加。

 

5.M1分泌外泌体H19

图5A：LPS/IFN‐γ同时刺激THP‐1，并与Huh7细胞在0.4 μm的孔板中共培养。通过RT-PCR检测结果显示，Huh7中H19的水平上调，有少量增加。

图5B：用Annexin V-PI检测结果显示共培养后Huh7细胞的凋亡增加。

图5C-D：用M1衍生的条件培养基(CM)或用外泌体抑制剂(GW4869)预处理的CM共培养24小时。通过RT-PCR检测结果显示GW4869抑制了H19的上调(C)；通过流式分析结果显示GW4869降低了Huh7的凋亡率(D)。

图5E：透射电子显微镜(TEM)检测M1来源的CM中分离外泌体，显示直径约100nm的杯状囊泡。

图5F：通过RT-PCR检测结果显示外泌体中的H19表达在单独使用RNase时没有变化，在同时使用RNase A和Triton X‐100处理后显著降低。

图5G：共聚焦荧光显微镜图像显示，M1来源的外泌体与Huh7共培养12小时后，PKH67标记的外泌体被内化。

图5H-I：RT- PCR检测H19在Huh7中的表达，结果显示增加几倍（H）； Annexin V‐PI分析Exos或PBS处理后Huh7细胞的凋亡情况（I）。

 

6.M1分泌的外泌体通过肝细胞凋亡加剧了ConA诱导的肝炎

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图6A：实验过程示意图，为分析M1衍生外泌体对ConA诱导的小鼠肝损伤的影响，从RAW264.7中分离出外泌体，同时用LPS和IFN‐γ刺激，小鼠通过尾静脉注射每天2次，共3次，每次约200μg外泌体或200μl PBS。

图6B：为了评估M1衍生外泌体的分布，在Dir标记外泌体或注射PBS后4hr，用IVIS光谱系统进行体内和体外荧光成像。结果显示，体内和离体荧光信号均在肝脏中积累。

图6C：HE染色结果显示更多坏死区域和广泛出血。

图6D-E：注射PBS或外泌体的ConA处理小鼠血清ALT和AST水平检测，结果显示外泌体移植后血清ALT和AST水平也较单独给药ConA略有升高。

图6F：通过RT-PCR检测炎症细胞因子IL- 6,、TNF -α、IFN-γ表达水平，结果显示外泌体处理后的炎症细胞因子水平升高。

图6G：转染外泌体后，通过RT - PCR检测结果显示，ConA处理小鼠肝脏中H19的表达升高。

图6H：Western blot检测凋亡蛋白Caspase-3、 BAX、p53表达水平，结果显示外泌体处理导致促凋亡蛋白升高。

图6I：肝脏TUNEL染色结果显示，DiL标记的外泌体在TUNEL阳性细胞中积累。

 

7.H19通过HIF‐1α-p53信号通路诱导肝细胞凋亡

图7A：流式细胞术分析转染H19或scramble后Huh7细胞的凋亡，过表达H19显著增加了Huh7。

图7B：免疫印迹分析结果显示，在scramble和过表达H19的Huh7细胞中，过表达H19显著增加了促凋亡蛋白p53、Caspase-3、BAX表达水平。

图7C：RT-PCR检测转录因子在scramble和over-H19 Huh7细胞中的表达水平，结果显示HIF‐1α是最受差异调节的因子。

图7D-E：通过免疫荧光（E）和western blot检测（D）HIF‐1α在Huh7中的亚细胞定位，发现H19过表达后HIF‐1α在细胞质中积累。

图7F：免疫印迹分析转染siH19的Huh7细胞中HIF-1α、p53和Caspase - 3的表达，结果显示H19在Huh7中沉默，显示细胞凋亡和HIF‐1α水平显著降低。

图7G-H：免疫印迹分析转染siHIF- 1α或sip53的NC/H19 Huh7细胞中p53和CC3的表达，结果显示，在HIF-1α被敲除后，p53在过表达H19 Huh7中的表达减少，以及细胞凋亡，而对H19没有反应（G）；在过表达H19 Huh7中沉默的p53减少了细胞凋亡，而HIF‐1α的表达保持不变（H）。

 

结论

 

在本研究中，作者发现H19在M1衍生的外泌体中表达，但是作者不能确定M1衍生的外泌体​H19在肝脏注射后被转运到肝细胞中。尽管ConA已被广泛用于模拟小鼠免疫介导的肝损伤，模拟人类AIH的临床特征，但AIH的机制仍有待确定。

总而言之，作者确定了H19在ConA诱导的肝炎中的作用，它来源于M1并通过外泌体转运到肝细胞，通过HIF1α‐p53信号通路促进肝细胞凋亡。这些发现代表了一种新的ConA诱导肝炎的机制。