骨质疏松症对公众健康有着深远的影响。一线双lin酸盐经常引起颌骨骨坏死，同时抑制破骨细胞。因此，开发有效的治疗方法非常重要。湾湾今天分享一篇发表在【Cell Death Disease】上题为“Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究，本研究结果显示，以4249A为功能位点的唑来lin酸(ZOL)引起的NFATc1 m6A甲基化水平升高与破骨细胞骨吸收减少高度相关。上游，METTL14通过NFATc1的甲基化功能位点调节破骨细胞骨吸收。下游，METTL14上调m6A甲基化水平后，YTHDF1和YTHDF2对NFATc1的转录后调控表现出拮抗作用。重要的是，本研究表明外泌体释放的METTL14可以提高NFATc1的m6A甲基化水平，抑制破骨细胞，帮助绝经后骨质疏松症患者保持骨量，避免引发颌骨骨坏死，成为治疗骨质疏松症的新型生物活性分子。

研究结果

1.高通量测序和差异表达基因

  

图1A-B：热图和火山图显示CON和ZOL组之间mRNAs的差异表达。

图1C：KEGG在和弦图中可视化。

图1D：基因集富集分析(GSEA)图利用RNA序列数据评估破骨细胞分化过程的变化。

图1E：两组mRNA转录组中m6A富集谱。

图1F：主要共识基序确定了两组的m6A序列峰。

图1G：CON组和ZOL组m6A序列中m6A峰数和m6A修饰基因数。

图1H：两组的m6A峰分布图显示了总m6A峰的比例。

图1I：维恩图显示了两组中654个具有差异表达和差异m6a甲基化的交叉基因(左)。根据mRNA和m6A甲基化水平对差异表达基因进行分类(右)。

图1J：通过交叉基因获得的差异表达基因，显示感兴趣的生物过程富集的气泡图。

 

2.ZOL对成骨细胞和破骨细胞的影响

图2A：加入不同浓度的ZOL后，在成骨诱导21天和7天后对MC3T3-E1细胞和BMSCs进行茜素红S或ALP染色。

图2B：不同浓度ZOL作用下MC3T3-E1细胞和骨髓间充质干细胞中ALP、Bglap、Col1α1和Runx2的相对表达水平。

图2C：采用TRAP染色和F-actin带染色检测不同浓度ZOL的破骨细胞分化和骨吸收能力。

图2D：不同浓度ZOL下TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率和细胞核的直方图。

图2E：不同ZOL浓度下RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。

图2F：western  blot检测不同ZOL浓度RAW264.7细胞裂解物中c-fos、NFATc1、RANK和NFκB p-P65蛋白水平。

图2G-H：免疫荧光图像和m6A点印迹法显示ZOL刺激后RAW264.7细胞的整体m6A水平。

图2I：热图显示ZOL刺激后m6A甲基化相关酶的差异表达。

图2J：ZOL刺激后，分别采用RT-qPCR和western blot检测RAW264.7细胞中METTL14 mRNA和蛋白的表达水平。

这些结果表明，随着浓度的增加，ZOL对rankl诱导的破骨细胞分化具有抑制作用，当ZOL浓度达到5 μM时，抑制作用最为明显。

 

3.ZOL或METTL14抑制破骨细胞分化，增加破骨细胞前体细胞m6A甲基化水平

图3A：采用TRAP染色和F-actin带染色检测两组间破骨细胞分化情况。

图3B：两组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图3C：两组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达水平。ZOL刺激后，将si-METTL14转染RAW264.7细胞，准备进一步研究。

图3D：采用TRAP染色和F-actin带染色检测两组间破骨细胞分化情况。

图3E：两组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图

图3F：两组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。

图3G：热图显示ZOL刺激后破骨细胞分化的差异表达基因。

图3H：KEGG分析揭示了三个交叉点的差异表达基因:破骨细胞分化基因、MeRIP超基因和mRNA下调基因。

图3I：RT-qPCR分析显示ZOL刺激或METTL14过表达后10个差异表达基因的表达水平。

图3J：NFATc1基因组定位示意图。

图3K：在ZOL刺激或不刺激的情况下，NFATc1转录本中meRIP-Seq的K-m6A峰值可视化。m6A峰位于NFATc1的3′UTRs区。

图3L：SRAMP网站上NFATc1潜在的m6A甲基化位点。

图3M：根据潜在的m6A甲基化位点，将NFATc1分为9个片段。

图3N：采用m6A-RT-qPCR检测ZOL刺激后抗m6A组与抗IgG组之间9段NFATc1的富集情况。

图3O:采用m6A-RT-qPCR检测ZOL浓度增加时NFATc1-9,10片段的富集情况。

图3P：采用m6A-RT-qPCR检测ZOL或si-METTL14刺激下NFATc1-9,10片段的富集情况。

图3Q-R：通过逐步突变荧光素酶报告基因来验证两个m6A修饰位点。

  这些结果表明，METTL14在RANKL诱导的破骨细胞分化过程中起关键作用。它的作用与ZOL类似。

 

4.NFATc1基因参与了METT14抑制破骨细胞分化的过程，只有NFATc1 - 9片段显示出高水平的m6A甲基化

图4A：采用TRAP染色和F-actin带染色检测两组间破骨细胞分化情况。

图4B：两组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图4C：两组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。接下来，将si-NFATc1转染RAW264.7细胞，准备进一步研究。

图4D：采用DTRAP染色和F-actin带染色检测两组间破骨细胞分化情况。

图4E：两组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图4F：两组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。接下来，将NFATc1或METTL14按不同组分别或同时转染RAW264.7细胞，为进一步研究做准备。

图4G：TRAP染色和F-actin带染色检测两组间破骨细胞分化情况。

图4H：两组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图4I：两组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达水平。

图4J：在ZOL或METTL14刺激下，根据线性回归分析估计NFATc1 mRNA半衰期。

图4K：ZOL刺激后，分别采用RT-qPCR和western blotting检测RAW264.7细胞中YTHDF1和YTHDF2 mRNA和蛋白表达水平。接下来，将si-YTHDF2或METTL14根据不同的组分别或同时转染到RAW264.7细胞中，准备进一步的研究。

图4L：采用TRAP染色和F-actin带染色检测各组间破骨细胞分化情况。

图4M：四组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图4N：四组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9、Acp5的相对表达量。

图4O-P：采用RT-qPCR和Western blot分别分析四组RAW264.7细胞中NFATc1 mRNA和蛋白的表达水平。

 

5.在METTL14甲基化水平升高后，YTHDF2对NFATc1的转录后调控有负面影响

图5A:采用TRAP染色和F-actin带染色检测各组间破骨细胞分化情况。

图5B：四组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图5C：四组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。

图5D：采用RT-qPCR和western blot分别分析四组RAW264.7细胞中NFATc1 mRNA和蛋白的表达水平。ZOL刺激后，将YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14按不同组分别转染RAW264.7细胞，准备进一步研究。

图5E：采用TRAP染色和F-actin带染色检测各组间破骨细胞分化情况。

图5F：四组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图5G：四组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。

图5H：采用RT-qPCR和western blot分别分析四组RAW264.7细胞中NFATc1 mRNA和蛋白的表达水平。接下来，根据不同组分别或同时将YTHDF1或METTL14转染到RAW264.7细胞中，为进一步研究做准备。

图5I：采用TRAP染色和F-actin带染色检测各组间破骨细胞分化情况。

图5J：四组间TRAP阳性破骨细胞数量、覆盖率及细胞核直方图。

图5K：四组RAW264.7细胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相对表达量。

图5L：采用RT-qPCR和western blot分别分析四组RAW264.7细胞中NFATc1 mRNA和蛋白的表达水平。

 

6.METTL14升高甲基化水平后，YTHDF1和YTHDF2对NFATc1的转录后调控具有拮抗作用

图6A-D：采用RIP法检测不同条件下nfatc1 - 9,10片段的富集率。

图6E：外泌体的电镜图像。

图6F：MC3T3-1细胞分泌外泌体的大小分布。

图6G：Western blotting分析MC3T3-E1细胞裂解物或MC3T3-E1细胞分泌外泌体中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63蛋白水平。

图6H：EphA2转染ME3T3-E1细胞后，分别采用RT-qPCR和western blotting检测EphA2外泌体mRNA和蛋白的表达水平。

图6I：外泌体的低温透射电镜图像。红色箭头表示纳米金探针(1.4 nm)与EphA2受体结合。

图6J：MC3T3-E1细胞外泌体进入RAW264.7细胞的免疫荧光图像。

图6K：荧光显微镜和TRAP染色分析显示pkh26标记的外泌体注射到骨髓中。红框表示外泌体被破骨细胞吸收。

图6L：免疫共沉淀(co-IP)分析显示EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的结合作用。

图6M：ME3T3-E1细胞转染METTL14后，分别采用RT-qPCR和Western blot检测METTL14外泌体mRNA和蛋白的表达水平。

图6N：大鼠体内成像分析显示，用Cy5.5标记的外泌体特异性定位于左上颌第一磨牙切除后的牙槽内。

图6O：拔牙8周后，大鼠双lin酸盐相关性颌骨骨坏死(BRONJ)及2个外泌体治疗组(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性图片。

图6P：注射ZOL或外泌体8周后，应用显微ct观察各组骨组织学变化。

 

7.外泌体中的METTL14在体内表现出明显的骨丢失修复作用

图7A-B：注射外泌体8周后，应用micro-CT和HE染色测定骨组织学参数。

图7C：五组之间BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp 和 BMD的直方图。

图7D：采用TRAP染色评价破骨细胞分化和骨吸收能力。

图7E：五组之间破骨细胞Oc. S/BS和TRAP的综合光密度的直方图。

图7F-G：采用Ctsk免疫组化和MMP9染色评价破骨细胞分化和骨吸收能力。

图7H-I：五组间Ctsk和MMP9综合光密度直方图。

图7J-K：皮质骨动态组织形态学代表性图像，MS/BS、MAR和BFR/BS定量。

图7L：小鼠体内成像分析显示，标记Cy5.5的外泌体特异性位于胫骨骨髓中。

 

结论

在一项体内研究中，外泌体释放的METTL14增强了NFATc1的m6A甲基化水平，从而抑制破骨细胞。这一现象是ZOL刺激后破骨细胞分化过程中的一种新的分子机制。此外，与双lin酸盐相比，外泌体释放的METTL14在体内不会引发颌骨骨坏死。

因此，METTL14将是一种比传统药物ZOL更安全的骨质疏松生物治疗药物。此外，作者发现了一种新的方法来提高外泌体靶向递送的有效性。体外和体内破骨细胞均可通过成骨细胞外泌体表面EphA2受体的过表达，从外泌体中摄取更多的METTL14。

这是因为破骨细胞表面有相应的EphrinA2配体。这一发现提示成骨细胞和破骨细胞可以通过EphA2-EphrinA2通路相互传递生物信号。结合本研究需要解决的临床问题，作者认为骨质疏松症对公众健康影响深远，抑制破骨细胞诱导的骨吸收是核心解决方案。作者认为EphA2在外泌体上的过表达是一种有效的靶向抑制破骨细胞的生物载体，可以帮助绝经后骨质疏松症患者在避免双lin酸盐副作用的同时保持骨量。重要的是，本研究提供了一种通过使用释放METTL14的外泌体来阻止破骨细胞分化的方法。