冠状动脉疾病的发病率正在上升。冠状动脉旁路移植术作为一种常用的治疗方法，在改善心脏问题的同时也会引起相应的并发症。静脉移植物再狭窄是最严重和最棘手的并发症之一。

干细胞衍生的外泌体可能具有治疗前景和价值。由于外泌体本身容易失活且容易被去除，这种治疗方法在临床实践中尚未得到广泛应用。甲基丙烯酸明胶(GelMA)是一种具有松散多孔结构的聚合物，可以维持外泌体的生物活性并控制其在体内的缓释。湾湾今天分享一篇发表在【J Nanobiotechnology】上题为“Exosomes from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells combined with gelatin methacryloyl inhibit vein graft restenosis by enhancing endothelial functions”的研究。在这项研究中，作者将人脐带间充质干细胞来源的外泌体(hUCMSC-Exos)和GelMA结合起来，探讨它们在抑制静脉移植物再狭窄中的作用和潜在机制。

 

研究结果

1.hUCMSCs和hUCMSCs - Exos的表征

图1a：光学显微镜下的间充质成纤维细胞样的外观图像。

图1b：流式细胞术分析hUCMSCs的表面标记物。hUCMSCs检测CD73、CD105和CD90呈阳性，但CD34、CD14、CD19、CD45和HLA-DR呈阴性。

图1c-e：MSCs具有分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞的能力。

图1f：透射电镜观察外泌体形态。

图1g：外泌体的粒径大小和浓度。

图1h：Western blot分析外泌体表面标记物CD9、CD81和CD63的表达。

 

2.GelMA和GelMA-Exos的表征

图2a：GelMA水凝胶无色透明。

图2b：GelMA水凝胶可以通过注射器使用。

图2c：扫描电镜观察GelMA和GelMA-Exos。

图2d：红外光谱仪分别分析GelMA水凝胶和GelMA-Exos。

图2e：分别对GelMA水凝胶和GelMA-Exos进行了x射线衍射(XRD)测试。

图2f：用流变仪测量GelMA和GelMA-Exos的存储模量和损耗模量

 

3.GelMA和GelMA-Exos的体内外降解

图3a：每5天测量一次GelMA-Exos的重量。

图3b：GelMA-Exos皮下植入小鼠，28 d后取出称重。

图3c：将水凝胶植入小鼠背部皮肤下。

 

4.将水凝胶植入小鼠背部皮肤下

图4a：皮下注入凝胶7天后小鼠脾脏免疫细胞的流式细胞术分析。

图4b：小鼠脾脏免疫细胞的定量分析。

图4c：小鼠主要脏器HE染色结果。

 

5.GelMA-Exos的释放及其在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)中的摄取

图5a：采用BCA法测定GelMA-Exos外泌体的控释曲线。

图5b：HUVEC的特征表面抗体:CD31和血管性血友病因子(vWF)。

图5c：免疫荧光法观察HUVECs对GelMA-Exos中外泌体的摄取情况。

 

6.GelMA-Exos促进HUVECs的迁移和增殖

图6a：在PBS中浸泡GelMA-Exos后，在不同时间点进行划痕试验的代表性图像。

图6b：定量分析各组不同时间点HUVEC迁移面积。

图6c：CCK-8检测HUVEC增殖。

图6d：Annexin V检测HUVEC细胞凋亡情况。

图6e：各组HUVEC细胞凋亡比例定量分析。

 

7.GelMA-Exos抑制静脉移植物的内膜增生

图7a：采用套管法建立大鼠静脉移植模型，在移植物周围涂上甲基丙烯酸明胶(GelMA)水凝胶。

图7b：彩色多普勒超声检查静脉移植物血管。

图7c：大鼠静脉移植血管的HE和Masson染色。

图7d：大鼠静脉移植物28 d后管腔面积的定量分析。

 

8.免疫荧光法检测内皮过程

图8a：静脉移植物管腔表面cd31阳性免疫荧光分布(绿色)。

图8b：定量分析各组cd31阳性细胞的覆盖长度比。

图8c：Western blot分析静脉移植物的总CD31。

 

图9a：静脉移植物中α- SMA阳性细胞的免疫荧光分布(绿色)。

图9b：静脉移植物中PCNA阳性细胞的免疫荧光分布(绿色)。

图9c：定量分析各组α-SMA的平均荧光强度。

图9d：定量分析各组PCNA平均荧光强度。

 

9.与静脉移植物再内皮化相关的关键调控途径

图10a：来自数据库中三个不同数据集的前100个miRNAs，取交集。

图10b：使用miRWalk2和Starbase2两种算法预测mRNA，并取交集。

图10c：GO分析可视化结果。

图10d：KEGG信号通路气泡图(基因计数≥5)。

图10e：基于STRING数据库预测170个基因之间的相互作用，并将结果可视化。

图10f：Western blot分析相关信号通路。

 

结论

 

总之，本研究中，作者构建了一个由hUCMSC-Exos和GelMA光敏水凝胶组成的复合物，可用于抑制静脉移植物再狭窄并延长其使用寿命。GelMA可携带外泌体并控制其缓慢释放，促进静脉移植物内膜内皮细胞增殖，从而引起“再内皮化”，防止早期内膜增殖。生物信息学分析和western blot结果显示，hUCMSCs-Exos可能通过激活PI3-AKT-mTOR通路调控内皮细胞的增殖和迁移。GelMA-Exos复合材料的应用在小鼠模型中没有引起免疫排斥或各种器官(心、肝、肺和肾)的毒性。因此，这种基于生物材料的外泌体治疗是一种很有前途的治疗静脉移植再狭窄的方法。