【Cell Death Disease】9分，circSKA3在细胞内的特异性保留通过减弱泛素化和SLUG的降解促进结直肠癌转移

近年来，环状RNAs (circRNAs)被认为是重要的表观遗传调控因子，参与多种肿瘤生物学过程，如细胞增殖、凋亡、自噬、血管生成、能量代谢、免疫监视、迁移和侵袭。通常，CircRNAs是通过亲本基因转录后的反剪接产生的。CircRNAs的生物学作用包括：海绵miRNAs、与功能性RNA结合蛋白(RBP)结合、逆转录后形成假基因、调节细胞核内基因转录或RNA剪接，甚至编码多肽等。

湾湾今天分享一篇发表在【Cell Death Disease】上题为“Specific intracellular retention of circSKA3 promotes colorectal cancer metastasis by attenuating ubiquitination and degradation of SLUG”的研究，在本研究中，研究了circSKA3在CRC转移中的生物学作用和分子机制，并探讨了circSKA3在CRC细胞内保留的调控。此外，还设计合成了靶向circSKA3的特异性反义寡核苷酸(ASOs)来干预结直肠癌的转移，这可能成为未来治疗癌症的新药物。

 

研究结果

1.CircSKA3在结直肠癌组织中表达升高，但在结直肠癌患者的血清外泌体中表达降低

图1A：10对正常肠黏膜腺瘤/腺癌组织样本的CircRNAs测序热图。

图1B：GEO数据库中AUC>0.9的CRC患者的CRC、腺瘤和血清外泌体中CircRNAs上调的Venn图。

图1C-D：采用不同引物和RNase R处理的RT-PCR方法，明确了circSKA3在HCT116细胞cDNA和gDNA中的头尾剪接

图1E：通过RNase R处理和RT-qPCR评估HCT116中circSKA3和线性SKA3的稳定性。

图1F：Dactinomycin对HCT116细胞circSKA3和SKA3 mRNA稳定性的评价。

图1G：RT-qPCR检测55对正常和结直肠癌样本中circSKA3的表达水平。

图1H：根据circSKA3表达水平对结直肠癌患者总生存率进行K-M生存分析。

图1I：105例正常人和72例结直肠癌患者血清中circSKA3的检测。

 

2.CircSKA3促进结直肠癌细胞迁移、侵袭和转移

图2A：circSKA3在结直肠癌细胞系中的表达。

图2B：靶向circSKA3 BSJ位点的shRNA序列示意图设计。

图2C：在HCT116和SW620细胞中通过shRNA敲低circSKA3。

图2D：Western blot检测circSKA3敲除后宿主基因SKA3蛋白水平。

图2E：Transwell法分析circSKA3敲除后HCT116和SW620细胞的迁移和侵袭能力。

图2F：circSKA3 BSJ位点的sgRNA设计原理图。

图2G：RfxCas13d-BSJ-gRNA在HCT116和SW620细胞中下调circSKA3的效率。

图2H-I：Transwell法分析RfxCas13d-BSJ-gRNA敲除circSKA3后HCT116和SW620细胞迁移和侵袭能力，右图为定量分析结果。

图2J：RfxCas13d-BSJ-gRNA敲低circSKA3对HCT116和SW620细胞增殖的影响。

图3A：基于pLCDH-ciR载体构建circSKA3过表达质粒示意图。

图3B：慢病毒表达载体在HCT8和SW480细胞中过表达circSKA3。

图3C：Transwell法分析circSKA3过表达后HCT8和SW480细胞的迁移和侵袭能力。

图3D：circSKA3在circSKA3敲低的HCT116细胞中过表达。

图3E：Transwell法分析circSKA3敲低HCT116细胞重新表达circSKA3后的迁移和侵袭能力。

图3F：裸鼠脾-肝转移模型构建示意图。

图3G：裸鼠脾脏和肝脏图像，箭头表示转移。

图3H：远端肝转移模型中平均肿瘤面积的定量分析。

图3I：裸鼠脾原位肿瘤HE染色。

图3J：肝转移灶HE染色。

图3K：裸鼠远处肝转移生存分析。

 

 3.结直肠癌细胞质中保留了致癌circSKA3

图4A：RT-qPCR检测circSKA3在HCT116和HCT8细胞中的分布。

图4B-C：透射电镜和Western blot检测HCT116和HCT8细胞中的外泌体。

图4D：转染circSKA3过表达载体的结直肠癌细胞、NCM460正常肠上皮细胞和293T细胞的外泌体分泌测定。

图4E：circSKA3截断质粒构建示意图。

图4F：截断circSKA3过表达载体(Δ1， Δ2， Δ3和Δ4)转染HCT8细胞的外泌体分泌测定。

图4G：截断circSKA3过表达载体转染HCT8细胞的外泌体分泌测定(Δ4-1和Δ4-2)。

图4H：circSKA3 FL和cellmotif (AGAAC)截断结构示意图。

图4I：转染上述两种载体的HCT8细胞外泌体分泌测定。

 

4.CircSKA3通过与结直肠癌中的SLUG相互作用促进上皮-间质转化(EMT)

图5A：基于DAVID在线工具对差异表达基因(DEGs)进行GO富集分析，确定circSKA3调控的生物过程。

图5B：CircSKA3敲低HCT116细胞的GSEA。

图5C：Western blot检测circSKA3敲低HCT116细胞和过表达circska3的HCT8细胞中EMT相关标志物。

图5D：质谱法检测SLUG的氨基酸序列。

图5E：Western blot检测RNA pull down实验中SLUG的表达。

图5F-G：Transwell法分析过表达截断的circSKA3和FL circSKA3后，HCT8细胞迁移和侵袭能力的定量分析。

图5H：RT-qPCR检测RIP实验中FL、Δ1-1、Δ4-2和Δcellmotif-truncated circSKA3的富集情况。

图5I：对照和敲低HCT116细胞CHX处理后不同时间点SLUG蛋白水平的统计图。

图5J：Western blot检测不同浓度MG132处理的circska3敲除和对照HCT116细胞中SLUG蛋白水平

图5K：IP法检测SLUG泛素化水平。

图5L：E-CADHERIN、VIMENTIN、SLUG在结直肠癌脾-肝转移小鼠模型中的表达。

图5M：人结直肠癌样本中circSKA3和VIMENTIN mRNA水平的相关性。

 

5. FUS通过结合特定基序调节circSKA3的环化

图6A：截断circSKA3质粒构建示意图。

图6B-C：CircSKA3的循环效率和线性SKA3水平。

图6D：质谱法鉴定FUS的氨基酸序列。

图6E：Western blot检测GST-RNA pull down试验中的FUS。

图6F：Western blot检测RIP实验中SLUG的表达。

图6G：RT-qPCR检测RIP中circSKA3的富集。

图6H：RT-qPCR检测FUS、circSKA3、SKA3 mRNA表达。

图6I：Western blot检测RIP中FLAG的含量。

图6J：RT-qPCR检测RIP实验中截断圆环ska3富集情况。

图6K：人结直肠癌样本中circSKA3和FUS mRNA水平的相关性。

 

6.靶向循环元件和细胞基序的ASOs抑制结直肠癌转移

图7A：ASOs的作用机理及化学改性示意图。

图7B：circSKA3和SKA3在ASO-NC组和靶向特定circSKA3基序的ASO处理组中的表达水平。

图7C-D：Transwell实验和定量分析ASO处理的HCT116细胞的迁移和侵袭能力。

图7E：尾静脉注射ASO治疗脾肝转移模型示意图。

图7F：原位注射HCT116细胞15天后脾脏和肝脏图像。

图7G：ASO处理后裸鼠体重变化。

图7H：ASOs处理裸鼠的脾脏和肝脏图像。

图7I：远处肝转移病灶数目。

图7J：脾肿瘤及肝转移灶的HE染色。

图7K-L：异种移植瘤ASO治疗后E-CADHERIN、VIMENTIN及SLUG的表达。

 

总结

综上所述，CRC细胞可能通过特定的细胞基序将circSKA3保留在细胞质中抑制外泌体分泌，细胞内circSKA3可阻断SLUG泛素化降解，促进CRC转移。此外，针对circSKA3的关键循环元件和功能基序的特异性ASO可能成为CRC的治疗药物