病毒性心肌炎(VM)是临床上常见的炎症性疾病。越来越多的文献表明，M2巨噬细胞可以保护小鼠免受柯萨奇病毒B3 (CVB3)诱导的VM。然而，M2巨噬细胞减轻心肌炎症的机制仍未明确。

        病毒性心肌炎(VM)是一种心脏炎症性疾病，通常表现为急性心肌炎，可发展为慢性VM、扩张型心肌病，甚至心衰。柯萨奇病毒B3 (CVB3)被认为是VM的关键病原体。然而，由于对CVB3诱导的VM的致病机制尚不清楚，目前尚无有效和特异性的治疗方法。大量的临床和实验研究表明，除了病毒介导的直接损伤外，免疫病理性心脏炎症是CVB3诱导VM的重要致病机制。湾湾今天分享的是一篇发表在【Redox Biology】上题为“M2 macrophage exosome-derived lncRNA AK083884 protects mice from CVB3-induced viral myocarditis through regulating PKM2/HIF-1αaxis mediated metabolic reprogramming of macrophages”的研究，在本研究中，作者假设M2-Exo可能通过控制VM心脏巨噬细胞的炎症特性而具有更好的治疗活性。研究结果表明，M2-Exo通过装载lncRNA，调节VM小鼠的巨噬细胞向M2表型转变，从而促进炎症的消退。M2-Exo发挥的有利特性，以及它们易于装载lncRNA，为治疗炎症（包括心血管系统）提供了一种新的治疗策略。

 

研究结果

1.心肌内灌注M2-Exo可减轻VM小鼠心肌炎症和心功能障碍

 

                                                                                                                                                                    

图1A：通过HE染色结果显示，M2-Exo减轻心肌炎症，如炎症灶受限、炎症面积缩小。

图1B-C：ELISA法检测血清cTnI水平，结果显示M2-Exo显著降低了血清cTnI水平和与全身性疾病相关的体重减轻。

图1D：在VM模型第10天测定小鼠的存活率，结果显示M2-Exo显著提高了VM模型的存活率，约为50%-75%

图1E：ELISA法检测小鼠心脏组织中IFN-γ、IL-4、IL-13水平，结果显示注射M2-Exo减少IFN-γ的产生，增加IL-4和IL-13的水平。

图1F：在存活5周的VM小鼠中，M2-Exo通过增加缩短分数(%)和射血分数(%)改善心功能。

这些结果表明，M2-Exo通过降低CVB3诱导的VM小鼠的死亡率和心功能障碍发挥保护作用。

 

2.在VM期间，M2-Exo促进巨噬细胞向M2表型转变

                                                                                                                                                                    

图2A：酶解后从小鼠心脏中分离出心肌浸润性巨噬细胞。流式细胞术分析CD11b+iNOS+或CD11b+Arg1+细胞的百分比。

图2B：采用qRT-PCR检测分选CD11b+巨噬细胞中NOS2、Arg1、FIZZ1和YM1的表达水平。

图2C：Western blot检测小鼠心脏组织中iNOS和Arg1表达水平。

图2D：在VM模型的第7天，将小鼠心脏制成石蜡切片。免疫荧光检测标记物CD68、iNOS、Arg1的表达。

这些数据表明，在VM下，M2-Exo处理使巨噬细胞从M1表型向M2表型极化。

 

3.LncRNA AK083884是M2-Exo介导的巨噬细胞极化的候选效应物

                                                                                                                                                                    

图3A：通过lncRNA测序分析，确定M2巨噬细胞极化中上调lncRNA与M2- Exo中富集lncRNA的交集后，选择lncRNA AK083884进行进一步分析。

图3B：采用qRT-PCR检测AK083884在M1和M2巨噬细胞中的表达水平。以GAPDH作为内参。

图3C：采用qRT-PCR分析M2-Exo中AK083884水平。

图3D：AK0883884位于小鼠10号染色体上SOCS2基因的第二个内含子上。

图3E：RNA FISH检测BMDMs中内源性AK083884(绿色)。DNA用DAPI染色(蓝色)。

图3F：CPC程序预测了AK083884、SOCS2和HOTAIR的编码电位。预测AK083884和HOTAIR为非编码RNA，而SOCS2 RNA为编码基因。

图3G：AK083884在M1或M2巨噬细胞极化过程中的时程表达分析。

图3H：采用qRT-PCR检测IL-4再极化M1—M2 24 h后巨噬细胞中AK083884的表达水平

图3I：采用qRT-PCR检测在LPS + IFN-γ作用24小时后，巨噬细胞中M2 - M1再极化后AK083884的表达水平。

图3J：采用qRT-PCR检测AK083884在VM小鼠心脏组织中的表达，在VM期间，AK083884的表达明显减少。

这些数据表明AK083884可能在调节巨噬细胞极化中发挥重要作用。

 

4.AK083884参与了体外M2-Exo介导的巨噬细胞极化

                                                                                                                                                                    

图4A：免疫荧光法检测BMDMs中PKH26标记的M2-Exo。

图4B：采用qRT-PCR检测AK083884在M2-Exo(si-NC)或M2-Exo (si-AK083884)中的表达情况。

图4C：采用qRT-PCR检测AK083884敲低对M1标记(NOS2)和M2标记(Arg1、FIZZ1和YM1)表达的影响。

图4D：通过M2-Exo(si-NC)和M2-Exo (si-AK083884)处理的BMDMs的尿素产量来评价M2标记物精氨酸酶活性。

图4E：用M2-Exo(si-NC)或M2-Exo(si-AK083884)培养后，Western blot检测BMDMs中M1标记物iNOS和M2标记物Arg1表达水平。

这些数据表明M2-Exo中的AK083884可能参与了巨噬细胞极化的调控。

 

5.AK083884通过调节SOCS2表达参与M2-Exo介导的STAT信号

                                                                                                                                                                    

图5A:M1或M2巨噬细胞中SOCS2表达的时间过程。

图5B-C:采用qRT-PCR和Western blot检测M2-Exo(si-NC)或M2-Exo (si-AK083884)处理的BMDMs中SOCS2的表达。

图5D：用M2-Exo处理BMDMs 0、0.5和2小时，Western blot检测p-stat1和p-stat6的表达。

图5E：Western blot分析不同M2-Exo处理组SOCS2过表达对BMDMs中p-stat6表达水平的影响.

这些结果表明，M2-Exo穿梭AK083884可能通过SOCS2/STAT信号通路调控巨噬细胞极化

 

6.AK083884与PKM2结合，是糖酵解代谢重编程的关键

                                                                                                                                                                    

图6A：Pull-down检测与AK083884结合的蛋白。SDS-PAGE银染色蛋白的质谱分析。

图6B：在质谱分析中取M2巨噬细胞中DEGs与蛋白的交集后，选择PKM2进行进一步分析。

图6C：使用抗PKM2抗体的RIP实验表明，PKM2在M2巨噬细胞中与AK083884相互作用。

图6D：AK083884和PKM2敲低对M2巨噬细胞细胞外酸化率(ECAR)的影响。左图:使用Seahorse XF24分析仪获得ECAR轨迹。右图:ECAR的非糖酵解酸化、糖酵解和糖酵解能力的统计分析。

图6E：AK083884和PKM2敲低对M2巨噬细胞耗氧量(OCR)的影响。左面板:使用Seahorse XF24分析仪检测OCR痕迹。右图:OCR的基线呼吸能力、最大呼吸能力、ATP耦合呼吸能力和备用呼吸能力的统计分析。

图6F：AK083884和/或PKM2敲低对M2巨噬细胞乳酸生成的影响。

图6G-H：用NC或PKM2siRNAs转染BMDMs48小时，然后用LPS+IFN-γ向M1巨噬细胞极化24小时，或用IL-4向M2巨噬细胞极化48小时。采用qRT-PCR检测M1巨噬细胞中M1标记物(IL-12、NOS2、TNF-α)和M2标记物(Arg1、YM1、FIZZ1)的表达水平。

这些数据表明，AK083884可能通过与PKM2的物理结合参与M2巨噬细胞的代谢重编程。

 

7.AK083884靶向PKM2并调节PKM2-HIF-1α相互作用

​                                                                                                                                                                    

图7A：qRT-PCR检测PKM2的表达。

图7B：Western blot检测PKM2的表达。

图7C：Co-IP法检测M2巨噬细胞中HIF-1α与PKM2的相互作用。

图7D：Co-IP检测AK083884敲低对M2巨噬细胞PKM2-HIF-1α相互作用的影响。

图7E：采用qRT-PCR检测在敲除AK083884或PKM2后测量M2巨噬细胞GLUT1、ENO1、LDHA、PDK1的表达水平。

这些数据表明，AK083884可能通过调节PKM2-HIF-1α相互作用参与糖酵解代谢重编程。

 

8.M2-Exo发挥心肌保护作用需要AK083884

                                                                                                                                                                   

图8A：酶解后从小鼠心脏中分离出心肌浸润性巨噬细胞。流式细胞术分析CD11b+iNOS+或CD11b+CD206+细胞百分比。

图8B：HE染色VM模型第7天处死的小鼠心脏，结果显示M2-Exo (si-AK083884)组小鼠心肌细胞间局灶性炎症细胞浸润面积显著增加。

图8C-D：左心室长轴b型图像测量心功能。各组小鼠射血分数和缩短分数的超声心动图分析。

 

结论

         在本研究中，首次证实了M2-Exo对CVB3诱导的VM的疗效。然后进行了巨噬细胞耗尽模型，表明巨噬细胞是M2-Exo的主要下游靶点。该研究进一步证明，M2- Exo有效促进了有利于M2而非M1表型的巨噬细胞的极化，从而可能减轻炎症，从而降低死亡率和心功能障碍。此外，作者发现lncRNA AK083884在M2-Exo中丰富，并调节巨噬细胞表型和SOCS2/STAT信号通路。机制研究发现AK083884直接与PKM2相互作用并调节PKM2-HIF-1α相互作用。