10分+高分文章，桑葚叶来源外泌体用于HCC靶向治疗的新策略

        肝细胞癌(HCC)是肝癌的主要组织学亚型，约占肝癌所有病例的90%。它是全球有关癌症死亡的第三大常见原因，因其发病率和死亡率不断上升而引起全球关注。外科治疗(如切除、移植和经导管动脉化疗栓塞)在临床HCC治疗中取得了初步成功。然而，这些治疗模式的固有局限性，包括患者依从性下降、肿瘤复发和高死亡率，导致了其实际应用的实质性障碍。同时，临床化疗药物面临缓解率低、不良反应严重、寿命延长有限等挑战，迫切需要新型肝癌治疗方法。

 

       湾湾今天分享的是一篇发表在【Journal of Nanobiotechnology】（影响因子10.6）上题为“Natural lipid nanoparticles extracted from Morus nigra L. leaves for targeted treatment of hepatocellular carcinoma via the oral route”的研究，该研究从桑树新鲜叶片提取并纯化了天然的类外泌体脂质纳米颗粒(MLNPs)。这些天然MLNPs富含糖脂、功能蛋白和活性小分子。体外实验显示，MLNPs通过半乳糖受体介导的内吞作用、增加细胞内氧化应激和触发线粒体损伤被肝肿瘤细胞系优先内化，从而抑制这些细胞的活力、迁移和侵袭。重要的是，体内研究表明口服MLNPs主要通过空肠和结肠进入循环系统，它们表现出轻微的不良反应和良好的抗肝肿瘤效果，通过直接杀死肿瘤和调节肠道微生物群。这些发现共同证明了MLNPs作为一种天然、安全且强大的纳米药物用于口服治疗肝细胞癌的潜力。

 

研究结果

1. MLNPs的理化表征

图1a：从桑叶中提取MLNPs。

图1b：MLNP的AFM图像，结果显示MLNPs在脱水后其直径约为100 nm。

图1c：MLNP的TEM图像，结果显示MLNPs在脱水后呈现为外泌体样球形颗粒。

图1d：流体动力学粒径分布，动态光散射(DLS)的进一步分析显示，MLNPs具有162.1 nm的流体动力学粒径，并表现出非常均匀的粒径分布(多分散性指数;PDI = 0.025)。

图1e：MLNPs的脂质组成，结果显示MLNPs含有5.0%的单半乳糖二甘油酯(MGDG)。

图1f：标准品色谱图。

图1g：MLNPs的色谱图，结果显示MLNPs中含有芦丁、槲皮素3-O-葡萄糖苷(Q3G)和shan奈酚3-O-葡萄糖苷(K3G)3种主要黄酮类化合物。

图1h：MLNPs的GO图，分析结果显示249个基因与仅由细胞解剖实体和含蛋白质复合物组成的细胞成分相关。

图1i：MLNPs的KEGG图，结果显示MLNPs中有34个蛋白与人类疾病和肝癌相关的信号通路相关。

生长因子(TGF-α、TGF-β、igf -Ⅱ和HGF)和Wnt信号通路在组织再生、细胞更新和某些病理状态(如癌前疾病和癌症)中被重新激活。Wnt/β-catenin蛋白通路在成熟和健康的肝脏中主要处于静止状态。相当大比例的肝肿瘤携带编码Wnt/β-catenin蛋白信号通路关键组分的基因突变。这些发现揭示了桑椹纳米囊泡抑制肝癌细胞的分子机制。

 

2. MLNPs的体外抗肿瘤活性

图2a-g：MTT法检测共孵育24和48 h后MLNPs对HepG2、Hepa1-6、A549、4T1、CT26、L929和MC3T3-E1细胞的潜在毒性,结果显示在HepG2、Hepa1-6、CT-26、4T1和A549细胞中，MLNPs对HepG2和Hepa1-6细胞表现出最大的细胞毒性。其中图2f-g结果显示，与肝癌细胞相比，MLNPs对健康细胞的毒性相对较低，表明它们具有良好的生物相容性。

图2h：MLNPs对不同细胞系的IC50值，结果中MLNPs处理的HepG2和Hepa1-6细胞暴露24小时后的IC50值分别为48.6和74.5 μg/mL，暴露48小时后的IC50值分别为12.0和17.0 μg/mL。

图2i：Calcein-AM/PI染色的Hepa1-6细胞荧光图像。活细胞用Calcein-AM染成绿色，死细胞用Calcein-PI染成红色，与对照组相比，在与MLNPs共孵育6、12和24小时后，Hepa1-6细胞显示出明显的红色荧光强度的时间依赖性增强。

图2j：定量分析活细胞或死细胞的荧光强度，结果显示MLNPs处理24小时后，细胞存活率约为60%，这一发现与MTT检测的结果一致。

图2k：MLNPs分别作用6、12、24 h对Hepa1-6细胞凋亡的影响，通过Annexin V-FITC/PI染色，结果显示接受MLNPs处理24小时的Hepa1-6细胞中，77.6%发生了晚期凋亡或坏死

图2l：MLNPs分别处理或不处理Hepa1-6细胞24和48h的迁移情况。

图2m：使用ImageJ软件检测有或没有MLNPs的Hepa1-6细胞的划痕愈合率MLNPs，在共培养24 h和48 h后，MLNPs分别处理或不处理的Hepa1-6细胞，伤口愈合率分别显著降低至9.3%和4.1%，表明其具有显著的抑制肝癌细胞迁移的能力。

图2n：MLNPs分别处理Hepa1-6细胞6、12、24 h后的transwell迁移能力。

图2o：ImageJ软件计数6、12、24 h的transwell迁移细胞数，

以上结果表明，MLNPs在HCC治疗中具有良好的应用前景。值得注意的是，图2n-o表明MLNPs在一定的时间范围内表现出时间依赖性的影响，以阻止肿瘤细胞的侵袭和转移。因此，实验假设MLNPs可以作为一种有前景的天然纳米药物来对抗转移性肝癌。

 

3. MLNPs的体外细胞摄取和抗肿瘤机制

图3a：CLSM图像和荧光分布轮廓。

图3b：5h后，Dio标记的MLNPs(绿色)的细胞摄取CLSM横断面图像。用DAPI(蓝色)和罗丹明鬼笔环肽(红色)标记Hepa1-6细胞。

图3c：Dio标记的MLNPs分别被Hepa1-6细胞内化1、3和5h的百分比，结果显示Hepa1-6细胞的摄取百分比分别为37.3%、66.0%和72.5%。

图3d、f：分别与MLNPs共孵育6、12、24 h后，Hoechst 33、342(蓝色)标记的Hepa1-6细胞内ROS变化的CLSM图像及定量，结果观察到绿色荧光强度逐渐增强，反映出MLNPs可以有效地诱导肝癌细胞中ROS的产生。

图3e、g：分别与MLNPs共孵育12、24、48 h后，JC-1和Hoechst 33,342染色的Hepa1-6细胞的CLSM图像及定量，在施用MLNPs后观察到红色荧光中的可识别衰减和绿色荧光中的同时增强。这些发现表明这些天然来源的MLNPs具有诱导线粒体膜结构损伤的能力。

图3h：流式细胞仪分析MLNPs与Hepa1-6细胞共孵育12 h或24 h后细胞周期的变化，MLNPs处理12 h和24 h后，G0/G1期细胞比例明显增加，S期细胞比例明显减少。

图3i：MLNPs抗肝肿瘤细胞的促凋亡机制示意图，MLNPs可以阻断Hepa1-6细胞的细胞周期，使其停滞在G0/G1期。

结果显示，随着与MLNPs孵育的延长，Hepa1-6细胞内的绿色荧光信号逐渐增加，与细胞骨架的红色荧光重叠，这一观察证实了MLNPs被Hepa1-6细胞有效内化，且主要分布在细胞质内。

 

4. MLNPs的体内生物分布和肝脏靶向性

图4a：MLNPs在模拟胃液、小肠液和结肠液中的稳定性，MLNPs在不同模拟溶液中的孵育过程中具有相对稳定的粒径和表面电荷，表明它们在GIT中的稳定性。

图4b：不同时间点(12、24、48和72 h)口服DiR-MLNPs的HCC小鼠模型中GIT的体外荧光图像，口服给药后，Dir标记的MLNPs在GIT中维持了72小时，从Dir标记的MLNPs发出的荧光强度在口服24小时后的GIT内达到顶峰。

图4c：体外肿瘤靶向荧光图像和Dir标记的MLNPs在肝癌原位小鼠模型中的生物分布，MLNPs的荧光信号与肝肿瘤完美重叠，表明其具有内在的肝肿瘤靶向能力。

图4d：来自经口施用DiO-MLNPs的小鼠的GIT切片的荧光图像, 在胃、空肠和结肠中均检测到明显的绿色荧光信号(MLNPs)。此外，这些绿色信号在胃的上皮层富集，而在空肠和结肠的黏膜中主要存在。

以上结果表明，MLNPs可能不是在胃中吸收，而是在空肠和结肠中吸收，它们在空肠和结肠中进入循环系统，并通过半乳糖受体介导的靶向作用在肝肿瘤中蓄积。

 

5. MLNPs抗肝癌的体内治疗结果

图5a：肝癌原位小鼠模型建立流程及治疗流程示意图。

图5b：经MLNPs治疗的原位肝癌小鼠的体重，在整个调查过程中，各组小鼠的体重没有明显差异。

图5c：经MLNPs治疗的原位肝癌小鼠的肝脏重量。与健康对照组相比，对照组(未进行处理)的肝脏重量有所增加。

图5d：经MLNPs治疗的原位肝癌小鼠的器官指数。与健康对照组相比，对照组(未进行处理)的肝脏指数有所增加。

图5e-h：经MLNPs治疗的原位肝癌小鼠的 BUN、AST、TBA、ALT的水平，水平分别降低1.1倍、2.1倍、2.0倍和1.5倍。

图5i-j：接受MLNPs口服治疗的小鼠肝组织的代表性数字照片、TUNEL、H&E和Ki67染色图像。图5i结果显示，与未处理的对照组相比，MLNPs (L和H)处理组的肝组织学明显改善。HE染色显示对照组(未治疗)存在早期肝脏肿瘤，表现为肝细胞核分裂和空泡变形。然而，口服MLNPs (L和H)显著减少了原发性肝脏肿瘤的表现(图5j)。采用TUNEL法和Ki67法分别标记肿瘤组织中细胞的凋亡和增殖情。

 

6. 口服MLNPs对肠道菌群的影响

图6a-b：Shannon指数和Chao指数的箱形图表示α-多样性，Chao和Shannon多样性指数的变化证明口腔MLNPs引起菌群多样性的改变。

图6c-d：常见和独特细菌种类的韦恩图及各组小鼠的微生物种类总数。结果表明，MLNP (H)处理组的菌落形成显著增加，有205株菌株(154株在所有小鼠组中共享，21株为该组独有)，这与Chao丰富度指数中观察到的趋势一致。

图6e：实验结果β-多样性的离散度。健康对照组、DEN/NMOR对照组和MLNP (H)处理组之间的距离反映了MLNPs对菌群重塑的积极作用，表明MLNPs可以在保持稳定的同时有效逆转化学致癌物引起的肠道菌群紊乱。

图6f：肠道菌群属水平的群落丰度百分比。与健康对照组相比，对照组(未进行处理)的有害细菌(例如Norank Muribaculaceae和Bacteroides)的相对丰度较高。

图6g：肠道菌群物种水平相对丰度热图。这些菌株与对照组(未处理)呈正相关，与健康对照组和MLNP (H)处理组呈负相关。

图6h：各小鼠组在门水平的微生物组成。DEN/NMOR对照组中厚壁菌门(Firmicutes)水平降低，拟杆菌门(Bacteroidota)和Patescibacteria水平升高。

图6i：各组肠道菌群主坐标分析(PCoA)。口服MLNPs给肝癌小鼠后，MLNP (H)处理组的集落结构与健康对照组小鼠的集落结构部分相交。

图6j-l：不同处理组中典型有益和有害细菌的相对丰度。

以上这些结果表明，MLNPs可以有效地调节肠道菌群的平衡。

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结论

        从桑树葚新鲜叶片中提取并纯化天然的类外泌体纳米囊泡，用于治疗肝癌。这些桑树新鲜叶片来源的脂质纳米颗粒(MLNPs)包含多种功能成分，包括脂质、蛋白质和类黄酮，其中半乳糖被确定为肝肿瘤靶向的潜在靶点。此外，它们在模拟胃肠道条件下表现出优异的稳定性和优异的生物相容性，因此非常适合在体内应用。体外实验表明，MLNPs表面的半乳糖基团有助于其被Hepa1-6细胞特异性内化，并增强其对肝肿瘤细胞的细胞毒性。MLNPs可使Hepa1-6细胞周期阻滞在G0/G1期，并诱导细胞凋亡。它们还触发了细胞内ROS水平的激增，并显著抑制肝癌细胞的增殖和迁移。MLNPs口服给药的生物安全性优于静脉给药，未引起免疫原性和毒副作用。在小鼠原发性肝癌模型中，口服MLNPs表现出显著的肝脏靶向和富集能力，显著抑制肿瘤生长和调节肠道微生物平衡。综上所述，MLNPs代表了一种天然、安全、环保的纳米药物，具有出色的肝肿瘤靶向能力，可用于肝细胞癌的口服治疗。