原发性胆汁性胆管炎机制不明确？“代谢组+转录组”面前“无处遁形”，12分，轻轻又松松！

   原发性胆汁性胆管炎（PBC）是一种自身免疫性肝病，其特征是进行性、非化脓性和破坏性肝内胆管炎，主要发生在女性中。然而PBC 的病因和发病机制尚不完全清楚。一些研究发现，微生物与免疫耐受的破坏和 PBC 的发病机制密切相关，为PBC的发病机制和进展提供了重要的见解。

   今天分享的是发表在【Gut Microbes】（IF：12.2）上题为“The fecal microbiota of patients with primary biliary cholangitis (PBC) causes PBC-like liver lesions in mice and exacerbates liver damage in a mouse model of PBC”的研究，该研究通过粪便微生物群移植（FMT）探讨了 PBC 患者肠道菌群对健康小鼠和PBC小鼠模型的影响；然后，通过比较 FMT与PBC患者引起的肝脏基因表达和通路的改变，进一步研究肠道菌群影响PBC 的潜在机制。

 

研究成果

1、PBC小鼠模型的建立

   在粪便微生物群移植（FMT）之前，C57BL/6小鼠接受抗生素混合物治疗 27 天。然后，每周给小鼠灌胃一次微生物悬浮液，持续8周。采用2-xin炔酸-牛血清白蛋白（2OA-BSA）和百日咳毒素建立PBC小鼠模型。分别在第 0、4 和 8 周收集粪便和血液样本；8周时收集肝脏和结肠样本（图1a）。检测血清样品中总胆汁酸（TBA）、丙氨酸转氨酶（ALP） 和 AMA-M2 的浓度（图1b）。通过 UPLC-MS/MS 定量分析 23 种血清胆汁酸（BA）（图1c）。

   3个月后，移植PBC患者粪便小鼠（PBC-FMT）的体重与移植健康对照组粪便小鼠（HC-FMT）的体重无显著差异。肝功能检测显示，在2OA- BSA诱导的PBC小鼠模型中， BA浓度和AMA-M2水平显著升高（图1b）。PBC-FMT导致ALP和TBA水平显著升高，这两者都是PBC的重要指标。相反，HC-FMT未引起小鼠肝功能指标的显著变化。与HC-FMT小鼠相比，PBC-FMT小鼠血清BA水平趋于升高 (P = 0.084)。这些结果表明，与HC-FMT相比，PBC-FMT更容易诱导小鼠TBA和ALP水平升高。

   BA的UPLC-MS/MS定量分析显示，与健康小鼠相比，2OA-BSA处理小鼠的胆酸、鹅去氧胆酸等显著升高，提示出现胆汁淤滞（图1c）。然而，尽管使用循环酶法发现PBC-FMT导致小鼠血清中TBA水平升高，但如上所述，UPLC-MS/MS分析的23种胆汁酸未发现显著升高。这种差异可能是由于分析方法的差异和使用的BA种类有限。总之，这些发现表明，PBC-FMT引起的TBA水平升高并不像2OA-BSA引起的升高那样导致胆汁淤积。

图1：PBC-FMT 增加小鼠血清 ALP 和总胆汁酸水平

 

2、PBC-FMT增加小鼠血清ALP和TBA水平和肝损伤

   PBC-FMT引起小鼠类似胆管炎的肝脏病变。HE染色显示，PBC-FMT小鼠肝脏表现出炎症表型，如胆管周围有中性粒细胞和巨噬细胞聚集，甚至小胆管部分消失（图2a）。这一发现与2OA-BSA诱导的PBC小鼠模型的小胆管改变非常相似。然而，在HC-FMT小鼠中没有观察到这些肝脏病变，这表明PBC-FMT（而不是HC-FMT）可以诱导小鼠小胆管损伤。

   接下来，通过比较肝脏差异表达基因富集的疾病相关通路（从患者、健康对照和小鼠的样本中提取粪便DNA，使用引物对338F和806R扩增16S rRNA基因的V3-V4区域，其5'末端标记有每个引物的特定条形码），进一步探讨PBC-FMT和HC-FMT对肝脏的不同影响。

   ·与健康小鼠相比，2OA-BSA处理小鼠肝脏的上调基因，在几种免疫疾病通路、传染病通路和癌症通路中显著富集（图2b）；下调基因在3种神经退行性疾病和化学致癌通路中显著富集（图2c）。

   ·与健康小鼠相比，PBC-FMT小鼠肝脏中上调的基因几乎包括了在2OA-BSA处理小鼠所有富集通路（除了磷脂酶D信号通路和癌症中的microRNA），包括与哮喘、感染性疾病、流体剪切应力和动脉粥样硬化相关，以及在糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路相关的新通路。与2OA-BSA处理的小鼠相比，PBC-FMT小鼠差异表达的基因未在任何疾病通路显著富集。

   ·与健康小鼠相比，HC-FMT小鼠只有下调的基因在化学致癌通路中显著富集（图2c）。与HC-FMT小鼠相比，PBC-FMT小鼠中转录上调的肝脏基因中富集的疾病通路包括系统性红斑狼疮、流体剪切应力和动脉粥样硬化，以及感染通路（图2d）。

   这些结果清楚地表明，PBC-FMT诱导的小鼠肝脏变化与2OA-BSA诱导的变化相似。

图2：PBC-FMT会增加小鼠的肝损伤

 

3、FMT小鼠反映了PBC患者和HC健康对照之间肠道微生物群的差异

   首先分析了FMT后小鼠的粪便微生物群，以确定可能在PBC-FMT相关肝损伤中发挥作用的微生物。根据α多样性分析，PBC-FMT和HC-FMT小鼠组的Simpson指数和Chao1指数均无差异，表明两组小鼠的物种均匀度和丰富度相似（图3a）。在PCoA中，PBC-FMT和HC-FMT小鼠的斑点明显分离，说明两组之间的微生物群结构存在显著差异。该结果通过排列多变量方差分析（PERMANOVA）得到验证（P = 0.035）（图3a）。

   与HC-FMT小鼠，PBC-FMT小鼠肠道内的一些细菌高度富集。例如，拟杆菌属HGA0123、另枝菌属Marseille-P2431和Caecibacterium sporoformans仅在PBC-FMT小鼠中检测到。PBC-FMT小鼠肠道中congonensis和Dorea sp.的相对丰度分别是HC-FMT小鼠的近4014倍和503倍。巴恩斯氏菌的平均相对丰度从HC-FMT小鼠的3.46％增加到PBC-FMT小鼠的9.25％。此外，粪拟杆菌、罗伊氏乳杆菌、Lactobacillus iatae、Ihubacter massiliensis和鼠伤寒杆菌也在PBC-FMT小鼠肠道中富集。

   相反，与HC-FMT小鼠相比，PBC-FMT小鼠肠道中的一些细菌被耗尽（丝状霍尔德菌仅在HC-FMT小鼠中发现）；产酸拟杆菌、Acetatifactor muris和假黄铜单胞菌的相对丰度仅为HC-FMT小鼠的10％左右；嗜碱菌、阿尔登梭菌、Papillibacter sp.和纤维状霍尔德曼氏菌也被耗尽（图3b）。

   接下来，分析了PBC患者粪便和灌胃HC小鼠粪便肠道菌群的差异，发现它们与 PBC-FMT和HC-FMT小鼠肠道菌群的差异部分一致。例如，梭菌科趋于枯竭；脱硫弧菌趋于富集；拟杆菌门如Alistipes sp. Marseille P2431富集；丝状霍尔德菌消失。然而，也观察到一些在FMT治疗小鼠中未检测到的差异，例如布氏瘤胃球菌的减少和星群链球菌的富集（图3c）。

图3：在 FMT 小鼠中检测到 PBC 患者和 HC 之间肠道微生物群的差异

 

4、PBC-FMT小鼠的肠道代谢组与 HC-FMT小鼠不同，且与改变的微生物有关

   使用GC-MS分析PBC-FMT小鼠和HC-FMT小鼠粪便代谢组，共鉴定出85种化合物。OPLS-DA显示，两组样本明显分离，表明代谢组谱存在显著差异（图4a）。依据VIP值，使用大于1.5的VIP作为阈值，3-(3-羟基苯基)丙suan、根皮酸和N -乙酰- D -氨基葡萄糖等代谢物对组间差异贡献显著（图4b）。进一步比较单个化合物的丰度显示，乳酸、5-羟基吲哚乙酸和2-亚油基甘油在PBC-FMT小鼠体内富集，而3-(3-羟基苯基)丙suan则减少（图4c）。

   将上述代谢物与PBC-FMT小鼠和HC-FMT小鼠肠道微生物丰度的差异进行关联，并以P < 0.05和绝对相关系数大于0.4为阈值筛选结果。PBC-FMT富含的Bacteroides congonensis、Bacteroides sp. HGA0123和Alistipes sp. marseile - p2431与PBC-FMT富含的5-羟基吲哚乙酸呈正相关，与PBC-FMT缺乏的3-(3-羟基苯基)丙wan酸呈负相关；Dorea sp.与5-羟基吲哚乙酸呈显著正相关，罗伊氏乳杆菌与3-(3-羟基苯基)质子酸呈显著负相关。此外，PBC-FMT富含的Ihubacter massiliensis和巴恩斯氏菌的丰度与PBC-FMT富含的乳酸呈正相关，而PBC-FMT缺乏的肠道微生物的丰度与乳酸呈负相关。此外，Bacteroides acidifaciens和Pseudoflavonoids ifractor sp.与3-(3-羟基苯基)质子酸呈正相关，而Alkaliphilus sp.和Clostridium aldenense与2-亚油基甘油呈负相关（图4d）。

图4：PBC-FMT 小鼠的肠道代谢组与 HC-FMT 小鼠不同，并且与改变的微生物有关

 

5、PBC-FMT 往往会上调免疫活性和信号转导，但会降低小鼠肝脏的代谢; PBC-FMT小鼠中表达上调的结肠基因仅在矿物质吸收通路中显着富集

   与健康小鼠相比，PBC-FMT小鼠、HC-FMT小鼠和2OA处理小鼠的肝脏基因转录本分别在75条、15条和67条通路上富集。在这些通路中，PBC-FMT组和2OA处理组均激活了53条通路，表明这两种处理可能涉及几种共同的机制。

   与HC-FMT小鼠相比，PBC-FMT小鼠肝脏基因的改变转录本主要富集于与免疫、代谢和信号转导通路相关的通路（图5a）。首先，在PBC-FMT小鼠中上调基因富集于13条通路，下调的富集在9条代谢通路。此外，上调的基因还富集于“粘附体连接”、“内质网蛋白加工”和“破骨细胞分化”等方面，下调的基因还富集于PPAR信号通路和脂肪消化吸收通路。

   采用Spearman方法分析PBC-FMT和HC-FMT小鼠的肠道微生物和代谢物，与肝脏基因转录差异的相关性。利用Metscape工具进行识别相关通路。结果表明：

   ·在疾病和免疫通路中定位的肝脏基因，主要与PBC-FMT富含的拟杆菌门呈正相关，如伴有金黄色葡tao球菌感染、阿米巴病、疟疾、恰加斯病、粘附连接和破骨细胞分化的拟杆菌门细菌；Alistipes sp. Marseille-P2431与朊病毒疾病和肿瘤转录失调相关；粪拟杆菌、Alistipes sp. Marseille-P2431与流体剪切应力、动脉粥样硬化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、补体和凝血级联以及IL-17信号通路相关；

   ·在代谢通路中与拟杆菌门呈负相关，在免疫通路中与厚壁菌门呈负相关；Alistipes sp. Marseille P2431与不饱和脂肪酸的生物合成和视黄醇代谢，以及产酸拟杆菌、Acetatifactor muris和Pseudoflavonifractor sp与NOD样受体信号通路和IL-17信号通路的相关。

   ·差异丰富的代谢物，如3-(3-羟基苯基)丙suan、N-乙酰- D -葡萄糖胺，参与破骨细胞分化、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、金黄色葡tao球菌感染、补体和凝血级联以及疟疾，与疾病和免疫通路相关的肝脏基因呈负相关；3-(3-羟基苯基)丙suan与趋化因子信号通路、流体剪切应力和动脉粥样硬化、阿米巴病、IL-17信号通路、恰加斯病、粘附连接、Rap1信号通路和造血细胞谱系相关；N -乙酰- D-氨基葡萄糖与Fc gamma R介导的吞噬、白细胞跨内皮迁移和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路相关（图5b）。

   与HC-FMT小鼠相比，PBC-FMT小鼠结肠中转录本上调的基因仅在矿物质吸收通路中显著富集，而下调的基因在任何通路中均未显著富集。富含矿物质吸收的结肠基因与粪拟杆菌正相关，但与肠道3-(3-羟基苯基)丙suan水平负相关（图5b）。

图5：PBC -FMT 倾向于上调免疫和信号转导，但下调小鼠肝脏的代谢

 

6、PBC-FMT加剧PBC小鼠模型的肝损伤

   PBC-FMT或HC-FMT后，2OA-BSA诱导的PBC模型小鼠血清TP、球蛋白和ALP水平均升高。与2OA-BSA诱导的PBC小鼠模型（2OA组）和相应的HC-FMT组（2OA- HC-FMT组）相比，PBC-FMT组（2OA-PBC-FMT组）血清GPDA水平更高（图6b）。病理学比较显示，与HC-FMT相比，PBC-FMT在小鼠PBC模型中诱导更多的炎症细胞聚集（图6c）。

   2OA-PBC-FMT组与2OA-HC-FMT组的肠道菌群差异显著。Shannon指数从前者到后者呈降低趋势。PCoA图显示两组之间的微生物群分布有显著差异。粪拟杆菌和Alistipes sp. Marseille P2431仅在2OA-PBC-FMT小鼠肠道中检测到。从2OA-HC-FMT组到2OA-PBC-FMT组，脱硫弧菌和Desulfovibrio sp. LNB1的平均相对丰度增加了10倍以上。此外，在2OA-PBC-FMT组中，产酸拟杆菌、化糖梭状芽胞杆菌和排泄物副腺杆菌被耗尽（图6d）。

   OPLS-DA图清楚地区分了两组的肠道代谢组谱。与另一组相比，2OA-PBC-FMT组小鼠的胆固醇、D-(-)-鼠李糖、花生四烯酸、乳酸、3-羟基丁suan和2-亚油基甘油含量增加，2 ' -脱氧肌苷含量减少（图6e）。

图6：PBC -FMT 加剧 PBC 小鼠模型的肝损伤

 

结论

   PBC患者肠道菌群的改变可能通过造血细胞谱系、PPAR信号通路等通路调节免疫代谢，在PBC的发生和进展中发挥重要作用。肠道菌群的改善作为PBC防治的重要方面值得深入研究和推广。