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宫腔粘连（IUA）是女性不孕的常见病因，目前普遍认为IUA的发生机制主要与子宫内膜干细胞异常、成纤维细胞过度活跃、雌激素受体缺乏有关。子宫内膜基质细胞（EndoSCs）在子宫内膜的周期性生长和再生中发挥着重要作用。然而，IUA 的传统治疗干预措施受到高复发率的困扰。人脐带间充质干细胞来源的细胞外囊泡 (hUCMSC-EVs) 对 IUA 表现出良好的治疗效果，但细胞外囊泡 (EVs) 目前的疗效因保留率和生物利用度较低而受到阻碍。

今天湾湾分享的是发表在【Journal of Nanobiotechnology】（IF=10.6）上题为“Thermosensitive hydrogel as a sustained release carrier for mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in the treatment of intrauterine adhesion”的研究，该研究使用了一种由聚（ε-己内酯-共丙交酯）-聚（b-聚乙二醇）-聚（ε-己内酯-共丙交酯）（PCLA-PEG-PCLA）组成的温敏水凝胶。分离hUCMSC-EVs并与温敏水凝胶联合进行IUA处理，结果表明，水凝胶-EVs复合物显著改善了IUA小鼠子宫腔中hUCMSC-EVs的保留。在IUA小鼠模型上证实了水凝胶- EVs复合物的增强治疗作用及其机制。

 

研究成果

1、hUCMSC-EVs及其温敏水凝胶的表征

图1A：通过TEM鉴定来自hUCMSC的EVs。

图1B：通过WB鉴定来自hUCMSC的EVs。

图1C: 通过NTA鉴定来自hUCMSC的EVs。

图1D：温敏水凝胶和水凝胶- EVs复合物的SEM图像。红色箭头表示hUCMSC-EVs。

图1E：不同温度下温敏水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）。

图1F：温敏水凝胶的G′和G”作为剪切应变的函数。

以上结果表明，热敏水凝胶具有良好的生物相容性。

 

2、水凝胶-EVs复合物中缓释hUCMSC-EVs

图2A：EVs或水凝胶-EV复合物与hEndoSCs共培养方案。

图2B：WB检测hEndoSCs培养上清液中CD63水平，分析CD63相对蛋白水平。

图2C：通过激光共聚焦显微镜观察hEndoSCs在特定时间点对PKH26标记的EVs的摄取情况，并分析PKH26的相对积分密度。

图2D：在有或没有温敏水凝胶的情况下评估EVs在体内保留的方案。

图2E：使用IVIS Lumina成像系统在指定时间点对小鼠进行DiR荧光信号检测。

图2F：DiR的荧光信号活性表示为[Photons (10⁷)/s/cm²/sr]/[µw/cm²]。

以上结果表明，热敏水凝胶在体外和体内均能提高hUCMSC-EVs的保留率。

 

3、水凝胶- EVs复合物可有效抑制hEndoSCs的凋亡和功能障碍

图3A：MTT法分析hEndoSCs活力。

图3B：WB检测PCNA蛋白水平。GAPDH作为标准化对照。

图3C：qRT-PCR检测hEndoSCs中PCNA mRNA水平。

图3D：hEndoSCs中PCNA的免疫荧光染色，PCNA的相对光密度分析。

图3E：流式细胞术分析hEndoSCs凋亡情况。计算Annexin V⁺ PI⁺细胞的比例。

图3F：WB和qRT-PCR分析hEndoSCs中Vimentin蛋白水平。GAPDH作为WB正常化的对照。

图3G：WB和qRT-PCR分析hEndoSCs中mRNA水平。GAPDH作为WB正常化的对照。

图3H：hEndoSCs中Vimentin的免疫荧光染色。分析了Vimentin的相对光密度。

以上结果表明，与水凝胶和EVs相比，水凝胶-EVs复合物显著逆转了MFT诱导的hEndoSCs迁移能力下降。这些观察结果表明，EVs的持续释放是防止hEndoSCs凋亡和维持hEndoSCs功能的有效策略。

 

4、水凝胶- EVs复合物显著抑制IUA小鼠模型子宫内膜损伤

图4A：动物实验示意图。雌性C57BL/6小鼠在子宫内注射95%乙醇20 s，然后用水凝胶、EVs或水凝胶- EVs复合物治疗。治疗两周后，收集血液和子宫组织。

图4B：建立IUA小鼠模型的具体步骤。(1)进入腹腔，暴露子宫。(2)夹紧子宫，给药入宫腔分组治疗。(3)将子宫恢复到原解剖位置，关闭切口。

图4C：治疗后子宫的代表性图像。

图4D：对子宫组织进行HE染色。

图4E：分析子宫内膜的相对厚度和腺体数量。

图4F：子宫组织膜联蛋白V免疫组化及TUNEL染色。

图4G：分析膜联蛋白V的相对光密度。

以上结果表明，热敏水凝胶可显著增强体外受精对IUA子宫内膜损伤的抑制作用。

 

5、水凝胶- EVs复合物显著改善子宫内膜纤维化

图5A：所示子宫组织进行天狼星红和马森染色。

图5B：TGF-β、α-SMA和CD31的免疫组化结果。

图5C：WB检测TGF-β、α-SMA、CD31、Smad2和p-Smad2。GAPDH作为WB正常化的对照。

图5D：qRT-PCR检测TGF-β、α-SMA、CD31 mRNA表达。

以上结果表明，热敏水凝胶显著增强了hUCMSC-EVs对子宫内膜纤维化的保护作用。

 

6、水凝胶-EVs复合物明显抑制炎症反应

图6A：采用小鼠外周血流式细胞术，分析Ly6C+单核细胞和Ly6G+中性粒细胞的比例。

图6B：Ly6C+单核细胞的比例。

图6C：Ly6G+中性粒细胞的比例。

图6D：ELISA法分析血清中TNF-α、IL-1β的含量。

图6E：免疫组化检测TNF-α和IL-1β。

图6F：WB检测TNF-α和IL-1β。

图6G：qRT-PCR检测TNF-α和IL-1β。

图6H：免疫组化分析HMGB1。

图6I：WB分析HMGB1。GAPDH作为WB正常化的对照。分析了HMGB1的平均光密度。

图6J：qRT-PCR分析HMGB1。

以上结果表明，水凝胶- EVs复合物在IUA炎症反应中起抑制作用。

 

7、水凝胶- EVs复合物显著提高了生殖能力

图7A：各组胚胎和新生小鼠的代表性图像。

图7B：对各组植入胚胎和新生小鼠的数量进行计数和分析。

以上结果表明，水凝胶- EVs复合物对IUA小鼠的生殖能力具有更强的治疗作用。重要的是，在任何一组中都没有观察到畸形的新生小鼠，表明宫内注射水凝胶-EVs复合物的生殖安全性。

 

​结论

该研究探索了温敏水凝胶作为hUCMSC-EVs缓释载体在IUA治疗中的应用。结果表明，水凝胶在体外和IUA小鼠模型中均显着延长了EVs的保留时间，并缓解子宫内膜损伤、抑制纤维化、抑制炎症和提高生殖能力的能力。总之，温敏水凝胶可以通过促进 EVs 在子宫腔内的长期保留来增强 hUCMSC-EVs 对IUA的治疗效果。