钙化大师脆弱拟杆菌细胞外囊泡的究极奥秘，14+的惊艳之作！

2型糖尿病（T2D）的血管钙化（VC）严重威胁患者的生命和健康。然而，其发病机制尚不清楚，导致缺乏对根本原因的有效治疗。发现T2D VC患者肠道脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis， BF）和外周血M2单核/巨噬细胞均显著升高。

M2巨噬细胞被认为是T2D VC的重要危险因素。BF及其胞外囊泡（EV）均能促进T2D VC，促进巨噬细胞M2极化。巨噬细胞清除可显著拮抗BF EV诱导的小鼠T2D VC。机制上，富含EV的双链DNA （dsDNA）激活干扰素反应刺激因子cGAMP相互作用因子1 (Sting)，促进肌细胞增强因子2D （Mef2d）磷酸化，上调tribbles pseudokinase 1 （Trib1）表达，诱导巨噬细胞M2极化。同时，Mef2d被EV靶向激活，上调促钙化因子Serpine1的表达，从而加重T2D VC。临床研究表明，T2D VC患者外周血Serpine1明显升高，与T2D VC密切相关。

湾湾今天分享的是发表在《Advanced Science》（IF：14.3）上题为“Bacteroides Fragilis Exacerbates T2D Vascular Calcification by Secreting Extracellular Vesicles to Induce M2 Macrophages”本研究揭示肠道BF通过EV-Sting-Mef2d通路促进Trib1表达，诱导巨噬细胞M2极化，上调serpin家族E成员1 （Serpine1）表达，从而加重T2D VC。研究结果为优化T2D VC的防治策略提供了新的理论和实验依据。

 

研究结果

1.T2D VC相关肠道细菌及作用途径分析

图1A：T2D和T2D VC患者肠道细菌丰度的16s rRNA测序分析。

图1B：T2D和T2D VC患者BF水平分析。

图1C：qRT-PCR分析T2D进展对肠道BF的影响。

图1D：病理分析T2D进展对主动脉钙化的影响。

图1E-F：流式细胞术分析T2D和T2D VC患者外周血M2单核/巨噬细胞表达变化及统计学分析。

图1G：T2D VC相关显著因素AUC的ROC分析。

图1H-I：病理和免疫组化分析BF移植对T2D小鼠主动脉的影响以及统计学分析。

图1J-K：病理和免疫组化分析BF移植对T2D小鼠骨髓细胞的影响及并统计学分析。

图1L-M：流式细胞术分析BF移植对外周血单核/巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

这些结果表明BF是一种与T2D VC相关的肠道细菌，并与M2巨噬细胞水平有关。

 

2.分析BF EV对VC和巨噬细胞极化的影响

图2A：BF囊泡大小分布的NTA分析。

图2B：BF EV结构的扫描电镜分析。

图2C：巨噬细胞和VSMCs摄取BF EV的观察。

图2D：qRT-PCR分析BF EV对VSMC成骨标记基因的影响。

图2E：Western blotting分析BF EV对VSMC成骨标志物基因的影响。

图2F：小动物体内成像分析BF EV在体内的分布。

图2G：光镜下分析BF EV对巨噬细胞形态的影响。

图2H-I：流式细胞术分析BF EV对巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图2J：qRT-PCR分析BF EV活化巨噬细胞对VSMC成骨标记基因的影响。

图2K：Western blotting分析BF EV活化巨噬细胞对VSMC成骨标志基因影响。

图2L-M：流式细胞术分析BF EV对T2D小鼠骨髓巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图2N：qRT-PCR分析BF EV对T2D小鼠主动脉钙化的影响。

图2O-P：病理和免疫组化分析BF EV拮抗HKBF对T2D小鼠主动脉钙化和骨髓M2巨噬细胞的抑制作用及统计学分析。

这些结果表明BF通过EV诱导巨噬细胞M2极化，从而促进主动脉钙化。

 

3.分析巨噬细胞清除对BF - EV加重小鼠T2D VC的影响

图3A：qRT-PCR检测粪便BF的表达。

图3B：血清肝功能指标检测。

图3C：血清血糖、血脂指标检测。

图3D：qRT-PCR检测主动脉成骨分化标志基因的表达。

图3E-G：外周血和骨髓巨噬细胞总量流式细胞术分析及统计学分析。

图3H-J：外周血和骨髓中M1/M2巨噬细胞的流式细胞术分析及统计学分析。

图3K：ELISA法检测血清中丝氨酸pine1的水平。

这些结果表明巨噬细胞是BF - EV促进T2D VC的关键靶细胞。

 

4.BF EV激活Sting-Mef2d信号，促进巨噬细胞M2极化

图4A：BF EV中DNA含量的检测。

图4B：光学显微镜观察，抑制Sting活性可拮抗BF EV诱导的巨噬细胞M2极化。

图4C-D：流式细胞术分析Sting活性拮抗BF EV诱导的巨噬细胞M2极化的抑制作用及统计学分析。

图4E：Western blotting分析BF EV和C-176 + BF EV处理对巨噬细胞基因表达的影响。

图4F：qRT-PCR分析BF EV对巨噬细胞基因表达的影响。

图4G：qRT-PCR分析C-176 + BF EV处理对巨噬细胞基因表达的影响。

图4H：Co-IP分析Sting与Mef2d相互作用。

图4I：Sting与Mef2d对接的生物信息学分析。

图4J-L：组织免疫荧光分析BF移植对T2D小鼠骨髓基因分布的影响， Sting与Mef2d共定位曲线及共定位散点图分析。

图4M-P：组织免疫荧光分析BF移植对T2D小鼠骨髓基因表达的影响，并对CD206⁺Sting⁺、CD206⁺Mef2d⁺、CD206⁺Sting⁺Mef2d⁺进行统计分析。

图4Q-R：流式细胞术分析Mef2d过表达对巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图4S-T：流式细胞术分析Mef2d抑制表达对巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图4U：Mef2d调控基因的转录组测序及生物信息学分析。

这些结果表明Sting是BF EV诱导巨噬细胞M2极化的关键基因，Mef2d是BF EV激活的重要下游功能基因。

 

5.Mef2d促进巨噬细胞M2极化和细胞因子分泌的机制分析

图5A：BF EV诱导M2巨噬细胞分泌细胞因子的维恩图分析。M1和M2是巨噬细胞极化诱导后GEO衍生的人单核细胞的转录组数据（GSE157182）。TS是处理RAW264.7细胞转录组测序数据的BF EV。

图5B：Venn图分析Mef2d调控的靶基因。Chip-Seq为Mef2d的测序数据。

图5C：Mef2d结合位点和突变位点在Trib1和Serpine1的非编码区。

图5D：双荧光素酶法分析Mef2d与Trib1非编码区的结合。

图5E：双荧光素酶试验分析Mef2d与Serpine1非编码区的结合。

图5F：qRT-PCR分析BF EV对巨噬细胞细胞因子表达的影响。

图5G：qRT-PCR分析C-176 + BF EV对巨噬细胞细胞因子表达的影响。

图5H：qRT-PCR分析Mef2d过表达对基因表达的影响。

图5I：qRT-PCR分析转染si-Mef2d对巨噬细胞基因表达的影响。

图5J-L：免疫荧光分析转染pcDNA3.1-Mef2d或si-Mef2d对巨噬细胞Serpine1表达的影响及统计学分析。

图5M-P：ELISA检测BF EV处理的巨噬细胞、pcDNA3.1-Mef2d转染的巨噬细胞培养上清、BF/BF EV移植的T2D小鼠、疾病进展期间T2D小鼠血清中Serpine1的水平。

这些结果表明Serpine1是Mef2d促进M2巨噬细胞分泌的关键蛋白。

 

6.分析Serpine1对T2D小鼠VC的影响

图6A：qRT-PCR分析Serpine1对VSMC成骨分化标志基因表达的影响。

图6B：Western blotting分析Serpine1对VSMC成骨分化标志基因表达的影响。

图6C-D：流式细胞术分析Serpine1对巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图6E：生化检测Serpine1输注对T2D小鼠肝肾功能的影响。

图6F：qRT-PCR分析Serpine1输注对T2D小鼠主动脉成骨分化相关基因表达的影响。

图6G-H：病理和免疫组化分析Serpine1输注对T2D小鼠主动脉Runx2和骨髓CD206+细胞的影响及统计学分析。

这些结果表明Serpine1促进T2D小鼠血管成骨分化。

 

7.血清Serpine1与T2D VC关系的临床水平分析

图7A-B：流式细胞术分析BF EV对THP -1源性巨噬细胞极化的影响及统计学分析。

图7C：qRT-PCR分析BF EV对THP -1源性巨噬细胞基因表达的影响。

图7D：Western blotting分析BF EV对THP -1源性巨噬细胞基因表达的影响。

图7E：ELISA分析BF EV对THP -1源性巨噬细胞Serpine1分泌的影响。

图7F：T2D VC患者血清Serpine1的ELISA分析。

图7G：Logistic回归分析Serpine1与T2D VC的相关性。

这些结果表明巨噬细胞M2极化和Serpine1分泌是T2D VC的重要危险因素。

 

结论

综上所述，该研究表明，T2D相关肠道BF分泌的EVs促进巨噬细胞M2极化并释放Serpine1，进而促进VC。临床研究进一步证实外周血M2单核细胞/巨噬细胞和外周血Serpine1是T2D相关VC的两个重要危险因素。本研究为优化T2D患者VC的防治策略提供了新的理论和实验基础。