国自然热点再上新!“外泌体”整出新花样，联合炎性细胞因子轻松发表10+!

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝病形式，包括以肝细胞甘油三酯蓄积为特征的非酒精性脂肪肝 (NAFL)和更严重的非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)。炎症介质肿瘤坏死因子 (TNF)和白细胞介素1β (IL1β)主要来源于肝脏中的肝巨噬细胞，在非酒精性脂肪性肝炎 (NASH)的进展中发挥着至关重要的作用。同时，静脉注射的外泌体（Exo）主要分布在肝脏中，被肝巨噬细胞摄取。以下这篇文章评估了通过外泌体靶向抑制肝巨噬细胞中TNF和IL1β表达作为NASH潜在治疗策略的可行性。

今天分享的是一篇发表在【Redox Biology】（IF：10.7）上题为“Exosome-equipped TNF antisense oligodeoxynucleotide or 2-deoxy-D-glucose ameliorated nonalcoholic steatohepatitis by modulating superoxide dismutase 1 in mice”的研究，该研究评估了通过外泌体（Exo）靶向抑制肝巨噬细胞中炎症介质肿瘤坏死因子 (TNF)和白细胞介素1β (IL1β)表达作为NASH潜在治疗策略的可行性，证明了输注负载抗TNF反义寡脱氧核苷酸（ASO-TNF）或2-脱氧-d-葡萄糖 (2DG)的外泌体可减轻小鼠模型中的实验性脂肪性肝炎。

 

研究成果

1. 2-脱氧-d-葡萄糖 (2DG)或抗TNF反义寡脱氧核苷酸 (ASO-TNF)减少巨噬细胞中炎症因子TNF / IL1β的表达

图1A：根据Gene Expression Omnibus数据库中的转录组数据集GSE167523对人类肝脏中 TNF和IL1β的表达进行分析。

图1B：根据转录组数据集GSE119340分析食物喂养和NASH诱导的小鼠肝脏中TNF和 IL1β的表达。

图1C：使用scRNAseq数据集GSE129516进行点图分析以评估肝细胞群中TNF和IL1β的表达水平。

图1D：用2DG和脂多糖(LPS)处理RAW264.7巨噬细胞或骨髓源性巨噬细胞 (BMDM)24小时，并使用qRT-PCR检测TNF和IL1β的表达。

图1E：用ASO-TNF转染RAW264.7细胞或BMDM 18-24小时，然后用LPS刺激24小时，并使用qRT-PCR测定TNF的表达。

图1F：RAW264.7细胞用2DG或ASO-TNF处理，Western blot检测TNF /IL1β的表达。

图1A-C结果表明，与NAFL患者相比，NASH患者的肝组织表现出更高的TNF和IL1β表达，小鼠NASH模型中TNF和IL1β表达水平有所升高，且肝巨噬细胞是TNF和IL1β的主要来源。

图1D-F结果表明，2DG 不仅能有效抑制 IL1β 表达，还能在转录和翻译水平上抑制 TNF 表达，而ASO-TNF有效减弱了巨噬细胞中的 TNF 表达。因此，2DG 和 ASO-TNF 被确定为抑制巨噬细胞中 IL1β /TNF 表达的潜在候选物。

 

2. ASO-TNF或2DG可以负载外泌体

图2A：负载ASO-TNF或2DG的外泌体示意图。

图2B：通过纳米颗粒追踪分析 (NTA)确定小鼠脑内皮细胞系3(bEnd.3)衍生的外泌体的尺寸分布。

图2C：通过透射电子显微镜 (TEM)观察外泌体形态。

图2D：通过Western blot检测bEnd.3细胞裂解物和外泌体中Alix、Tsg101、Flotillin-1和 Vdac1的水平。

图2E：将BMDM与装载有德克萨斯红标记和胆固醇修饰寡核苷酸的外泌体一起孵育。12小时后，用抗小鼠肝脏F4/80+抗体对BMDM进行染色并通过荧光显微镜进行分析。

图2F：将胆固醇修饰的乱序miRNA (NC)或miR-188-5p mimic(miR)与外泌体一起孵育，并通过qRT-PCR检测外泌体中miR-188-5p的水平。

图2G：通过电穿孔将2DG加载到外泌体中，并通过葡萄糖氧化酶法测量外泌体中2DG的浓度。

以上数据的结果证实了ASO-TNF或2DG可以有效地负载外泌体。

 

3. Exo/ASO-TNF或Exo/2DG在体外和体内抑制巨噬细胞中的TNF / IL1β 表达

图3A-B：将BMDM与Exo、Exo/2DG、Exo/ASO-Control (Exo/ASO-CT)或Exo/ASO-TNF一起孵育24小时，然后更换并用含有LPS的新鲜培养基再反应24h，qRT-PCR检测TNF和IL1β的表达。

图3C：RAW264.7巨噬细胞与Exo、Exo/2DG、Exo/ASO-CT或Exo/ASO-TNF一起孵育24小时，然后用LPS处理24小时，并且表达Western blot检测TNF和IL1β。

图3D：通过尾静脉将DiI标记的外泌体注射到蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）喂养的小鼠体内。6小时后，使用生物发光成像检查肝脏、肺、脾、肾和心脏中的DiI信号。

图3E：肝脏切片用抗小鼠F4/80抗体染色并通过荧光显微镜进行分析。

图3F：给小鼠喂食MCD饮食4周，最后2周通过尾静脉注射Exo/ASO-TNF或Exo/2DG  4次，使用磁激活细胞分选术 (MACS)分离F4/80 +肝巨噬细胞，通过流式细胞术测定F4/80 +细胞的纯度。

图3G：通过qRT-PCR测量F4/80 +肝巨噬细胞中TNF和IL1β的mRNA水平。

以上结果表明Exo/ASO-TNF或Exo/2DG在体内外均有抑制巨噬细胞TNF和/或IL1β表达的潜力。

 

4. Exo/ASO-TNF或Exo/2DG减弱体外肝细胞中的脂质积累

图4A：示意图显示BMDM用Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理1天，更换并用含有LPS的新鲜培养基培养1天，并收获条件培养基(CM)。然后，在存在或不存在TNF/IL1β的情况下，在棕榈酸培养基(PA)中将原代小鼠肝细胞与CM一起培养2天。

图4B：使用油红O染色评估原代肝细胞中的脂质积累。

图4C：对(B)中油红O染色的阳性面积进行定量比较。

图4D：测量原代肝细胞中的甘油三酯 (TG)含量。

结果表明，与对照CM相比，来自Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的CM显著减弱了诱导原代肝细胞或AML12细胞中脂质积累的能力，此外，补充TNF /IL1β部分恢复了这种效果。

 

5. Exo/ASO-TNF或Exo/2DG减轻氨基酸限定饮食（CDAA）喂养或蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）喂养小鼠的实验性脂肪性肝炎

图5A：使用Exo/ASO-TNF或Exo/2DG治疗用CDAA饮食喂养的小鼠脂肪性肝炎的程序示意图。小鼠以CDAA饮食喂养10周，最后2周通过尾静脉注射Exo/ASO-TNF或Exo/2DG4次。

图5B：肝脏切片通过H&E染色进行染色。

图5C： (B)中脂肪变性面积和炎症评分的定量比较。

图5D：血清中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和甘油三酯 (TG)的检测。

图5E-F：肝脏切片用油红O染色，并对阳性区域进行定量和比较。

图5G：肝组织匀浆中TG的检测。

图5H-I：对肝脏切片进行F4/80免疫组织化学染色。定量比较F4/80染色的阳性面积(I)。

图5J-K：通过qRT-PCR测定肝脏中TNF、IL1β和脂肪酸代谢相关基因的mRNA水平。

图5L：通过Western blot测定TNF、IL1β和转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Pparγ）的蛋白水平。

图6A：Exo/ASO-TNF或Exo/2DG治疗MCD饮食小鼠脂肪性肝炎的流程示意图。

图6B：肝脏切片进行H&E染色。

图6C：(B)中脂肪变性面积和炎症评分的定量比较。

图6D：血清中ALT、AST和TG的检测。

图6E-F：肝脏切片用油红O染色，并对染色阳性区域进行定量和比较。

图6G：肝组织匀浆中TG的检测。

图6H-I：对肝脏切片进行F4/80免疫组织化学染色。定量比较F4/80染色的阳性面积(I)。

图6J-K：通过qRT-PCR测定肝脏中TNF、IL1β和脂肪酸代谢相关基因的mRNA水平。

图6L：采用Western blot法测定肝脏中TNF、IL1β和Pparγ的蛋白水平。

结果表明输注Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以有效减轻肝脏脂质积累，同时，发现Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以改善 CDAA或MCD饮食诱导的小鼠NASH。

 

6. Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可通过Sod1减弱肝细胞中的脂质积累

图7A：使用RNA-seq分析Exo/ASO-TNF、Exo/2DG或Exo处理的CDAA喂养小鼠肝脏样本的mRNA表达。研究了Exo/ASO-TNF或Exo/2DG与Exo组之间的基因集富集分析。

图7B：热图显示Exo/ASO-TNF或Exo/2DG和Exo组之间RNA-seq数据中前30个上调基因。

图7C：通过qRT-PCR测量PBS、Exo、Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的小鼠肝脏中Sod1 的mRNA水平。

图7D：通过Western blot检测PBS、Exo、Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的小鼠肝脏中Sod1的水平。

图7E：肝组织匀浆中总Sod活性的检测。

图7F：通过qRT-PCR测量PBS、Exo、Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的CDAA喂养小鼠肝脏中过氧化氢酶的mRNA水平。

图7G：通过蛋白质印迹检测PBS、Exo、Exo/ASO-TNF或Exo/2DG处理的CDAA喂养小鼠肝脏中过氧化氢酶的水平。

图7H-I：CDAA-小鼠或MCD-小鼠肝组织中H ₂ O ₂含量的检测。

图7J：用Sod1 siRNA转染肝细胞AML 12，12小时后，用RAW264.7条件培养基(CM)和新鲜棕榈酸培养基培养2天。使用油红O染色评估AML12细胞中的脂质积累。

图7K：对(J)中油红O染色的阳性面积进行定量比较。

图7L：测量AML12肝细胞中的甘油三酯 (TG) 含量。

这些结果证实了Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以通过上调Sod1表达来减少肝细胞中的脂质积累。

 

7. Sod1抑制剂LCS-1抵消了Exo/ASO-TNF或Exo/2DG对CDAA诱导的小鼠NASH的治疗作用

图8A：Exo/ASO-TNF或Exo/2DG和Sod1抑制剂LCS-1用于治疗用CDAA饮食喂养的小鼠脂肪性肝炎的程序示意图。最后两周通过尾静脉注射Exo/ASO-TNF或Exo/2DG四次。每次外泌体输注后的第二天，将溶解在玉米油中的LCS-1腹膜内注射。

图8B：血清中ALT和AST的检测。

图8C：对喂食CDAA的小鼠的肝脏切片进行H&E染色、油红O染色或F4/80免疫组织化学染色。

图8D：肝脏切片进行天狼星红染色，或使用抗肌动蛋白α2平滑肌（αSMA）进行免疫组织化学染色。

图8E-G：(C)中脂肪变性区域、油红O染色阳性区域或F4/80 +区域的定量比较。

图8H：肝组织匀浆中TG的检测。

图8I-J：对(D)中αSMA免疫组织化学染色或天狼星红染色的阳性信号进行定量比较。

体内实验的结果表明在CDAA喂养的小鼠模型中，Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可以通过上调Sod1抑制NASH进展。

 

8. Sod1与TNF处理的肝细胞或CDAA喂养小鼠肝脏中的JNK通路激活呈负相关

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图9A-B：用TNF或PBS的棕榈酸培养基(PA)处理AML12肝细胞2天。随后，通过Western blot测定pJNK、JNK、Sod1和ɑTubulin的蛋白水平，并定量比较pJNK或Sod1的积分密度。

图9C-D：使用蛋白质印迹分析评估CDAA喂养小鼠肝脏中pJNK、JNK 和ɑ微管蛋白的蛋白质水平。

根据以上实验结果，作者推测Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可能下调TNF等炎症因子，从而抑制肝细胞中JNK信号的激活，随后促进Sod1表达的上调。

 

结论

本研究证明了负载ASO-TNF或2DG的外泌体在体外和体内抑制巨噬细胞中TNF或/和IL - 1β的表达，输注Exo/ASO-TNF或Exo/2DG可减少CDAA或MCD喂养的小鼠肝脏脂肪沉积，抑制肝脏炎症，阻止肝纤维化，最终减轻实验性脂肪性肝炎。在机制上，作者发现Exo/ASO-TNF或Exo/2DG治疗可能通过上调Sod1的表达来缓解实验性NASH的进展。因此，输注负载ASO-TNF或2DG的外泌体是一种有前景的NASH治疗策略，值得进一步研究。