4图14+！国自然热点开炫—“细胞外泌体”充当守门人？更多功能有待探索……

细胞外囊泡（EVs）与细胞间通讯、免疫反应、病毒致病性、心血管疾病、神经系统疾病和癌症进展有关。EVs将蛋白质、代谢物和核酸输送到受体细胞中，有效地改变受体细胞的生理和生物反应。在从供体细胞到受体细胞的运输过程中，EVs面临不同的离子浓度，这可能会损害其完整性并影响其货物含量。已知EVs的膜上有离子通道和转运体，但这些通道在EVs中的功能和作用尚不清楚。

湾湾今天分享的是发表在【Nature COMMUNICATIONS】（IF：14.7）上题为“Functional large-conductance calcium and voltage-gated potassium channels in extracellular vesicles act as gatekeepers of structural and functional integrity”的研究，该研究发现了一个功能性钙激活的大电导钾通道（BK_Ca）。还确定BK_Ca对于EVs的结构和功能完整性至关重要。这些发现确定了离子通道如BK_Ca在作为看门人和维持EVs介导的信号传导方面的关键作用。

研究结果

1.细胞外囊泡膜中存在对iberiotoxin（IBTX）敏感的K⁺电流

图1a:使用Western blots对C57BL/6NCrL小鼠分离的血浆源性EV进行鉴定。

图1b：显示有/没有EVs的近场电生理（NFE）实验方法的方案。

图1c：跟踪显示，在EVs存在时K⁺电流增加（黑色），在IBTX存在时K+电流被抑制（橙色）。

图1d：在含有1 mM DTT的不对称KCH₃SO₃中，在500:50 mM顺式和反式范围内，记录了裂解EV膜上K⁺通道的单通道电流。

图1e：d中相应迹线的频率直方图。

图1f：不对称KCH₃SO₃中钾离子通道电流-电压（I/V）曲线。

图1g：被IBTX阻塞的K⁺电流的代表性迹线。

图1h：在IBTX存在或不存在的情况下，K⁺电流阻断的百分比。

图1i：从C57BL/6NCrL分离的纯化等离子体源性EVs的CryoTEM图像。

图1j：从Kcnma1^+/+小鼠中分离的EVs在生理[K⁺]细胞外[4 mM]和细胞内[145 mM]浓度下孵育，并与PBS进行比较。[K⁺]的增加与EVs的尺寸成正比。

图1k：与IBTX相比，Kcnma1^+/+离子载体NS1619增加了EVs的大小。

图1l：与PBS相比，从Kcnma1^−/−分离的EVs在细胞外[4 mM]和细胞内[145 mM]浓度下孵育。Kcnma1^-/-EVs失去K⁺处理能力。

图1m：与Kcnma1^−/−小鼠相比，Kcnma1^+/+小鼠分离的EVs平均大小。

图1n-o：Kcnma1^+/+和Kcnma1^−/−小鼠循环血浆EVs浓度。

 

2.EVs中BK_Ca通道的存在

图2a：Western blot分析显示从小鼠血浆中分离的EVs中存在BK_Ca和蛋白负载控制。

图2b-i：Kcnma1^+/+小鼠和标记pkh67和抗BK_Ca的Kcnma1^−/−小鼠纯化的EVs。

图2j-u：人iPSC来源的心肌细胞（hiPSC-CM）与Kcnma1^+/+和Kcnma1^−/−标记的pkh67分离的EVs孵育。将hiPSC-CM装入WGA并固定用于免疫细胞化学分析。hiPSC-CMs经渗透并标记抗BK_Ca抗体和DAPI。所有图像在n和t中合并。o和u分别是n和t的缩放区域。BK_Ca存在于Kcnma1^+/+（黄色箭头）分离的EVs中，但不存在于Kcnma1^−/−小鼠中。

 

3.EVs中的BK_Ca通道减弱氧化应激介导的hiPSC-CMs效应

图3a：Nanostring分析显示，与Kcnma1^−/− EVs相比，Kcnma1^+/+ EVs中miR的上调（14）和下调（28）存在差异。

图3b-d：与Kcnma1^−/− EVs相比，miR-19a、miR23a和miR-486在Kcnma1^+/+ EVs中表达上调。

图3e-g：与Kcnma1^−/− EVs相比，Kcnma1^+/+小鼠的Let-7g、miR-15a和miR-144下调。

图3h：hiPSC-CMs中多电极阵列（MEA）的活动图显示了拍频和场电位持续时间。

图3i：无EVs、Kcnma1^+/+ EVs和Kcnma1^−/− EVs组hiPSC-CMs孵育后的心率。

图3j：hiPSC-CMs中MEA的活动图显示miR处理后的拍频和场电位持续时间。

图3k：H₂O₂处理后，15a mimic、15a inhibitor、23a mimic和23a inhibitor处理hiPSC-CMs的心率。

图3l：在H₂O₂存在或不存在的情况下，对经scr mimic-、scr inhibitor-、miR-15a mimic-、miR-15a inhibitor-、miR23a mimic-和miR-23a inhibitor-处理的hiPSC-CMs释放的LDH进行量化。

 

4.EVs中的BK_Ca通道介导心肌缺血再灌注损伤的心脏保护

图4a-b：建立野生型小鼠体内缺血再灌注损伤模型。所有小鼠进行45分钟的LAD结扎，然后再灌注72小时。再灌注后，将Kcnma1^+/+和Kcnma1^−/−小鼠的EVs送入心内。心肌切片用Masson染色，观察野生型小鼠移植豚鼠肝细胞后的心肌纤维化情况。

图4c：与Kcnma1^+/+小鼠分离的EVs相比，注射Kcnma1^−/−分离的EVs的野生型动物显示纤维化增加。Kcnma1^+/+（蓝色）和Kcnma1^−/−（红色）小鼠左心室纤维化的定量。

图4d：无心肌梗死野生型小鼠超声心动图m型图像。

图4e：野生型小鼠心肌梗死后的m型超声心动图，并移植Kcnma1^+/+小鼠分离的EVs。

图4f：野生型小鼠心肌梗死后的m型超声心动图，移植了Kcnma1^−/−小鼠分离的EVs。

图4g：各组小鼠（假手术小鼠和结扎小鼠注射Kcnma1^+/+和Kcnma1^−/−小鼠分离的EVs）左心室射血分数（LVEF）的定量。

图4h：各组小鼠左心室短缩率（LVFS）定量测定。结扎小鼠与假手术小鼠（野生型）相比，LVEF和LVFS降低。然而，与Kcnma1^−/−小鼠的EVs相比，移植Kcnma1^+/+小鼠分离的EVs小鼠的LVEF和LVFS均有所改善。

 

结论

总的来说，该研究结果表明，EVs具有功能性离子通道，这对于维持其完整性和功能作用至关重要。本研究的重点是大电导K+通道（BKCa），因为K+离子的能势在膜上是最高的。本研究对离子通道和转运体在EVs中的作用的进一步研究加深了对其功能的理解，并可能导致临床环境中的实际应用。通过利用EVs的独特特性，可以开发新的诊断工具和治疗方法，利用它们在细胞通信和疾病过程中的作用。