【Mol Plant】17.1+，外泌体介导昆虫miRNA调控植物防御，会是农业新转机？

植食性昆虫在与寄主植物长达4亿年的共同进化过程中，发展出了多种操控寄主植物防御的机制，其中唾液效应分子是其重要“武器”。目前已知的昆虫唾液效应分子多为蛋白质和小分子化合物，而小RNA（sRNAs）在调控基因表达方面发挥着关键作用，但其作为昆虫唾液效应分子调控植物防御的作用尚未明确。

烟粉虱（Bemisia tabaci）是一种极具危害性的多食性害虫，能对全球农业生产造成巨大损失。此前研究发现烟粉虱的sRNAs存在于番茄韧皮部，但功能未知。

 

湾湾今天分享的是发表在【Mol Plant】（IF：17.1）上的题为“A small RNA effector conserved in herbivore insects suppresses host plant defense by cross-kingdom gene silencing”的研究。该研究旨在探究烟粉虱唾液中的miRNA是否能作为效应分子调控植物防御，以揭示昆虫与植物相互作用的新机制。

 

研究结果

1、鉴定释放到烟草植物细胞中的烟粉虱miRNA效应分子

图1A：通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析，发现BtmiR29-b在烟粉虱唾液腺中的表达水平较高。

图1B：RT-qPCR检测显示，BtmiR29-b在成年烟粉虱中的表达水平高于若虫。

图1C：RT-PCR检测结果表明，在烟粉虱样本中可检测到BtmiR29-b、BtmiR2779和BtmiRbantam-3p三种miRNA，但仅BtmiR29-b在唾液腺中富集并在唾液中被检测到。

图1D：在受烟粉虱侵染的烟草植株叶片中，仅检测到BtmiR29-b。

图1E：在受烟粉虱侵染的烟草植株韧皮部渗出液中，也仅检测到BtmiR29-b。

图1F：当新羽化的烟粉虱取食烟草时，烟粉虱体内BtmiR29-b的水平上调。

图1G：随着烟粉虱取食时间增加，寄主烟草植株中BtmiR29-b的丰度逐渐上升。

这些结果表明，BtmiR29-b可在烟粉虱取食时分泌到烟草、拟南芥和棉花等不同寄主植物细胞中，具备作为效应分子的潜力。

 

2、BtmiR29-b效应分子增强烟粉虱的适应性

图2A：在过表达BtmiR29-b的转基因烟草植株（p35S::BtmiR29-b）上，烟粉虱的存活率和繁殖力显著增加，表明这些植株对烟粉虱更敏感。

图2B：利用拟南芥蔗糖转运蛋白2（AtSUC2）启动子驱动BtmiR29-b表达的转基因烟草植株，同样表现出生长变差且对烟粉虱防御能力降低的现象。

图2C：在过表达BtmiR29-b人工靶标模拟物（mimic29-b）的转基因烟草植株上，烟粉虱的繁殖力显著降低，而存活率未发生明显变化。

图2D：用化学修饰的单链RNA类似物antagomir29-b处理烟粉虱后，烟粉虱体内BtmiR29-b的丰度降低。

图2E：被antagomir29-b处理后的烟粉虱侵染的烟草植株，其体内BtmiR29-b水平也较低。

图2F：取食经antagomir29-b处理烟粉虱的烟草植株后，烟粉虱的存活率和繁殖力显著下降。

图2G：用agomir29-b处理烟粉虱后，烟粉虱体内的BtmiR29-b水平显著升高。

图2H：经agomir29-b处理的烟粉虱，向寄主植物释放的BtmiR29-b更多。

图2I：与喂食阴性对照（agomirNC）的烟粉虱相比，喂食agomir29-b的烟粉虱在烟草植株上取食时，存活率和繁殖力呈上升趋势。

这些结果表明，过表达或干扰BtmiR29-b分别增强或抑制烟粉虱在烟草植株上的生存和繁殖能力，表明其能调控烟草对烟粉虱的防御。

 

3、BtDicer1介导BtmiR29-b效应分子的产生，外泌体系统介导BtmiRNA29-b的分泌

图3A：喂食dsBtDicer1/2沉默烟粉虱的BtDicer1和BtDicer2基因后，烟粉虱体内BtDicer1和BtDicer2的表达水平显著降低。

图3B：同时沉默BtDicer1和BtDicer2后，烟粉虱体内BtmiR29-b的丰度降低。

图3C：被沉默BtDicer1和BtDicer2的烟粉虱侵染的寄主植物中，BtmiR29-b的丰度也降低。

图3D：基因表达分析显示，仅BtDicer1基因在烟粉虱唾液腺中呈现相对较高的表达，与BtmiR29-b的表达模式相似。

图3E：单独敲低BtDicer1后，烟粉虱体内BtmiR29-b的丰度受到抑制。

图3F：被敲低BtDicer1的烟粉虱侵染的烟草植株中，BtmiR29-b水平降低。

图3G：单独敲低BtDicer2后，烟粉虱体内BtmiR29-b的丰度未发生明显变化。

图3H：被敲低BtDicer2的烟粉虱侵染的烟草植株中，BtmiR29-b水平也未明显改变。

图3I：在烟草植株上，喂食dsBtDicer1的烟粉虱表现显著下降。

图3J：喂食dsBtDicer2的烟粉虱在烟草植株上的表现未明显下降。

图3K：在烟粉虱中鉴定出外泌体形成相关基因BtCD63、BtSyntenin和BtSMPD，它们在中肠中均有较高的表达水平。

图3L-N：分别沉默BtCD63、BtSyntenin和BtSMPD基因后，在烟草中检测到的BtmiR29-b减少。

图3O：烟粉虱中参与货物分选的BtVPS37a、参与多囊泡体运输的BtRab27a和参与BtmiR29-b分泌的BtVAMP7基因，在中肠和唾液腺中呈现不同程度的高表达。

图3P-R：分别沉默BtVPS37a、BtRab27a和BtVAMP7基因后，烟粉虱侵染时释放到寄主烟草植株中的BtmiR29-b减少。

这些结果表明，BtDicer1参与BtmiR29-b的产生，烟粉虱外泌体系统相关基因（BtCD63、BtSyntenin、BtSMPD、BtVPS37a、BtRab27a、BtVAMP7）参与其分泌，影响烟粉虱在烟草植株上的表现。

 

4、BtmiR29-b抑制NtBAG4转录本的积累并抑制寄主植物防御

图4A：烟粉虱侵染后，烟草植株中NtBAG4转录本的积累受到抑制。

图4B：用BtmiR29-b的抑制剂antagomir29-b处理烟粉虱后，被这些烟粉虱侵染的烟草植株中NtBAG4的表达增强。

图4C：用agomir29-b处理烟粉虱后，被侵染的烟草植株中NtBAG4的表达受到抑制。

图4D-E：在过表达BtmiR29-b的转基因烟草植株（p35S::BtmiR29-b和pAtSUC2::BtmiR29-b）中，NtBAG4的表达降低。

图4F：在过表达NtBAG4的转基因烟草植株（p35S::NtBAG4）上，烟粉虱的存活率和繁殖力显著降低，表明烟草对烟粉虱的防御能力增强。

图4G：利用病毒诱导基因沉默（VIGS）抑制NtBAG4表达后，有利于烟粉虱在烟草寄主上的生存。

图4H：在选择实验中，烟粉虱更偏好野生型烟草植株，而非p35S::NtBAG4转基因烟草植株。

图4I：与对照烟草植株相比，NtBAG4沉默的植株对烟粉虱的吸引力增强。

图4J：序列分析表明，BtmiR29-b靶向NtBAG4的编码区（245-265bp），其种子区域与NtBAG4完全匹配。

图4K：降解组测序验证了烟草NtBAG4在烟粉虱取食时会被BtmiR29-b切割，切割位点与预测的BtmiR29-b靶位点相符。

图4L：烟粉虱侵染表达GFP-NtBAG4的烟草叶片后，GFP-NtBAG4的表达受到抑制；但当NtBAG4的BtmiR29-b靶位点突变（GFP-NtBAG4-m）后，烟粉虱侵染无法抑制其表达；同时，GFP-NtBAG4与BtmiR29-b共表达时，其表达受到抑制，而突变体GFP-NtBAG4则不受影响。

这些结果表明，BtmiR29-b靶向并沉默烟草防御基因NtBAG4，NtBAG4表达影响烟草对烟粉虱的防御能力和驱避性，且BtmiR29-b对NtBAG4的靶向作用得到多实验验证。

 

5、NtBAG4通过上调NtPAL表达促进SA积累

图5A：与野生型烟草相比，过表达NtBAG4的转基因烟草植株（p35S::NtBAG4）中水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）的含量显著增加。

图5B：与野生型相比，p35S::NtBAG4转基因烟草植株中NtPAL2的表达显著增强。

图5C：在VIGS-NtBAG4的烟草植株中，NtPAL2的表达受到抑制。

图5D：用antagomir29-b处理烟粉虱后，取食这些烟粉虱的烟草植株中NtPAL2转录本水平显著增加。

图5E：用agomir29-b处理烟粉虱后，取食这些烟粉虱的烟草植株中NtPAL2转录本水平显著降低。

图5F-G：在过表达BtmiR29-b的转基因烟草植株（p35S::BtmiR29-b和pAtSUC2::BtmiR29-b）中，NtPAL2的表达降低。

图5H：在过表达mimic29-b的烟草植株上，烟粉虱侵染后NtPAL2的表达升高。

这些结果表明，NtBAG4通过上调NtPAL2促进SA积累增强烟草防御，BtmiR29-b可通过降解NtBAG4干扰NtPAL2表达，削弱烟草防御。

 

6、MiR29-b可作为蚜虫效应分子并靶向番茄中的防御基因SlBAG4

图6A：MpmiR29-b在桃蚜唾液腺和唾液中被检测到。

图6B：MpmiR29-b在被桃蚜侵染的烟草植株及其韧皮部汁液中被检测到。

图6C：在过表达MpmiR29-b的烟草植株上，蚜虫的表现更好。

图6D：在过表达mimic29-b的烟草植株上，蚜虫的表现更差。

图6E：桃蚜侵染可抑制烟草植株中NtBAG4的表达。

图6F：在过表达NtBAG4的转基因烟草植株（p35::NtBAG4）上，蚜虫的生存状况较差。

图6G：在VIGS-NtBAG4的烟草植株上，蚜虫的表现更好。

图6H：通过Northernblot分析发现，BtmiR29-b可从烟粉虱转移到番茄韧皮部汁液中。

图6I-J：通过瞬时过表达和TRV介导的基因沉默实验表明，SlBAG4参与番茄对烟粉虱的抗性。

图6K-L：烟粉虱侵染和BtmiR29-b瞬时表达均可抑制番茄中SlBAG4的表达。

图6M：烟粉虱侵染和BtmiR29-b瞬时表达可切割预测的SlBAG4靶位点，但对突变位点无影响。

图6N：在烟粉虱侵染时，瞬时过表达mimic29-b可增加SlBAG4的mRNA水平。

图6O：瞬时过表达mimic29-b可增强番茄对烟粉虱的防御能力。

这些结果表明，不仅烟粉虱的BtmiR29-b，桃蚜的MpmiR29-b也可作为效应分子抑制植物防御，且BtmiR29-b能靶向番茄的SlBAG4基因，抑制番茄对烟粉虱的防御反应。

 

结论

本研究首次证实昆虫miRNA可作为唾液效应分子调控植物防御。烟粉虱唾液中的BtmiR29-b可通过烟粉虱Dicer1产生，经外泌体分泌到寄主植物细胞中，劫持植物AGO1蛋白，靶向沉默防御基因BAG4，抑制植物SA和JA介导的防御反应，从而增强烟粉虱的适应性。miR29-b在多种植食性昆虫中保守，在蚜虫中也发挥类似效应分子作用，且可能靶向多种被子植物的BAG4基因。该研究为理解昆虫与植物相互作用机制提供了新视角，也为农业害虫防治提供了潜在的新靶点和理论依据。