【Free Radic Biol Med】7+，外泌体“泌”招，抑制铁死亡，椎间盘退变“变”轻松！

慢性腰痛（LBP）是全球常见疾病，而椎间盘退变（IVDD）是其主要病因，严重影响人们生活。当前IVDD治疗方法主要是手术和药物，只能缓解症状，无法有效延缓或阻止疾病进展。因此，探索IVDD的发病机制并寻找新的治疗方法至关重要。

近年来发现的铁死亡与IVDD的发展密切相关，铁死亡在退变的椎间盘组织中异常表达，且铁过载会促进IVDD。间充质干细胞（MSC）来源的外泌体（EXOs）在再生医学中具有潜力，能保留MSC的治疗特性，还可抑制铁死亡，但EXOs在抑制铁死亡缓解IVDD方面的研究较少，机制也不明确。

 

湾湾今天分享的是发表在【Free Radic Biol Med】（IF：7.1）上题为“Exosomes inhibit ferroptosis to alleviate intervertebral disc degeneration via the p62-KEAP1-NRF2 pathway”的研究。该研究旨在探讨EXOs是否通过抑制铁死亡来缓解IVDD，并揭示其潜在机制，为IVDD的治疗提供新方向。

 

研究结果

1、退变的IVD组织中铁死亡标记物的异常表达

 

图1A：展示了IVDD患者腰痛的示意图。

图1B：不同等级IVDD患者的MRI图像（Pfirrmann分级）。

图1C：不同等级IVDD患者腰痛的视觉模拟评分（VAS），结果显示疼痛严重程度随IVDD退变增加。

图1D-H：免疫荧光（IF）检测FTH1、GPX4、PTGS2、ACSL4的表达，随退变等级增加，FTH1和GPX4表达逐渐降低，PTGS2和ACSL4表达逐渐增加。

图1I-K：IF检测MMP13和Col2A的表达，MMP13表达与IVD退变程度正相关，Col2A表达与退变程度负相关。

图1L-M：免疫组化（IHC）检测FTH1和PTGS2的表达，FTH1表达随退变等级增加而降低，PTGS2表达增加。

图1N-O：IHC检测MMP13和Col2A的表达，结果与IF检测一致。

这些结果表明，铁死亡标记物在退变的IVD组织中异常表达，提示铁死亡可能在IVDD的发展和进展中发挥作用，同时ECM降解与IVDD进展相关。

 

2、铁死亡参与TBHP诱导的细胞死亡

 

图2A：显微镜下观察到TBHP（150μM）和RSL3（15μM）处理3小时后NP细胞的形态变化，呈现铁死亡特征的“气球样”表型。

图2B：MTT检测不同浓度TBHP处理3小时对NP细胞活力的影响，以及TBHP、RSL3、erastin处理后细胞活力变化，还有Fer-1和DFO预处理6小时对TBHP损伤细胞的保护作用，结果显示NP细胞活力随TBHP浓度增加而降低，Fer-1和DFO可提高被TBHP抑制的细胞活力，RSL3和erastin降低细胞活力。

图2C：EdU检测不同浓度TBHP处理的NP细胞增殖情况，细胞增殖随TBHP浓度增加而逐渐减少，DFO可逆转TBHP对细胞增殖的抑制作用，RSL3与TBHP作用相似。

图2D：Western blot分析不同浓度TBHP处理3小时后NP细胞中FTH1、GPX4、PTGS2、ACSL4蛋白水平变化，GPX4和FTH1表达下降，ACSL4和PTGS2表达增加。

图2E：Western blot分析不同浓度RSL3处理3小时后NP细胞中相关蛋白水平变化，趋势与TBHP处理相似。

图2F：检测不同浓度TBHP处理的NP细胞脂质过氧化水平，TBHP处理后脂质过氧化水平增加。

图2G-H：Western blot分析DFO和Fer-1预处理6小时对TBHP处理的NP细胞中相关蛋白水平的影响，DFO和Fer-1可逆转TBHP诱导的FTH1和GPX4表达下降，以及ACSL4和PTGS2表达增加。

图2I：检测上述不同处理的NP细胞脂质过氧化水平，结果与蛋白水平变化一致。

图2J-K：IF检测不同处理下NP细胞中FTH1的表达，Fer-1和TBHP处理组FTH1荧光强度高于TBHP单独处理组，Erastin处理组FTH1荧光强度较低。

图2L：透射电镜（TEM）观察不同处理下NP细胞线粒体形态变化，TBHP和RSL3刺激使线粒体收缩、嵴密度增加、外膜破裂，Fer-1处理可改善TBHP诱导的线粒体形态变化。

这些结果表明，铁死亡在氧化应激诱导的NP细胞死亡中起关键作用。

 

3、EXOs减轻TBHP和RSL3诱导的NP细胞铁死亡

 

图3A：TEM观察EXOs形态，呈杯状或球形。

图3B：纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示EXOs粒径主要在50-200nm之间。

图3C：Western blot检测EXO标记蛋白Alix、CD63和内质网蛋白Calnexin，结果显示提取的纳米颗粒富含Alix和CD63，缺乏Calnexin。

图3D：Dil染色显示EXOs可随时间被NP细胞内化。

图3E-F：MTT检测TBHP或RSL3处理3小时对NP细胞活力的影响，以及EXO预处理6小时的保护作用，EXOs显著抑制TBHP和RSL3诱导的NP细胞活力下降。

图3G-H：EdU检测TBHP或RSL3处理3小时的NP细胞增殖情况，以及EXO预处理6小时的保护作用，EXOs可逆转TBHP或RSL3导致的NP细胞增殖减少。

图3I-J：Western blot分析TBHP或RSL3处理3小时，有无EXO预处理6小时的NP细胞中FTH1、GPX4、PTGS2、ACSL4蛋白水平变化，EXOs显著逆转TBHP或RSL3诱导的FTH1和GPX4下调，以及ACSL4和PTGS2上调。

图3K：IF检测不同处理下NP细胞中FTH1的表达，趋势与Western blot结果相似。

图3L：检测不同处理下NP细胞脂质过氧化水平，TBHP显著诱导脂质过氧化，EXOs和/或Fer-1干预可逆转该过程。

图3M：TEM观察不同处理下NP细胞线粒体形态变化，EXO处理可挽救TBHP诱导的线粒体形态变化。

这些结果表明，EXOs可减轻TBHP或RSL3诱导的NP细胞铁死亡。

 

4、TBHP诱导NP细胞退变，铁死亡抑制剂和EXOs可减轻该过程

 

图4A：Western blot分析不同浓度TBHP处理3小时后NP细胞中Col2A和MMP13蛋白水平变化，MMP13表达逐渐增加，Col2A表达逐渐减少。

图4B：Western blot分析TBHP或RSL3处理3小时，以及Fer-1预处理6小时对NP细胞中Col2A和MMP13蛋白水平的影响，Fer-1可逆转TBHP诱导的蛋白表达异常，RSL3诱导蛋白表达异常。

图4C-D：IF检测不同处理下NP细胞中MMP13和Aggrecan的表达，TBHP或RSL3处理使MMP13荧光强度增加，Aggrecan荧光强度降低，Fer-1干预可逆转这些效应。

图4E-F：Western blot分析TBHP或RSL3处理3小时，以及EXO预处理6小时对NP细胞中MMP13和Col2A蛋白水平的影响，EXOs可逆转TBHP或RSL3诱导的MMP13表达增加和Col2A表达减少。

图4G：IF检测不同处理下NP细胞中ADAMTS5的表达，结果与上述蛋白变化一致。

这些结果表明，TBHP诱导NP细胞退变，铁死亡抑制剂和EXOs可减轻这一过程，EXOs可能通过抑制细胞外基质降解来减缓IVDD进展。

 

5、EXOs通过调节p62/KEAP1/NRF2轴减轻NP细胞氧化应激诱导的铁死亡

 

图5A-B：Western blot分析TBHP或RSL3处理3小时，以及EXO预处理6小时对NP细胞中NRF2和KEAP1蛋白水平的影响，TBHP和RSL3增加KEAP1表达，降低NRF2表达，EXO干预激活NRF2表达，降低KEAP1表达。

图5C-D：IF检测不同处理下NP细胞中NRF2的表达，结果与Western blot一致。

图5E：Western blot分析ML385共处理后NP细胞中FTH1、GPX4、PTGS2、ACSL4蛋白水平变化，ML385逆转了EXOs对铁死亡标记蛋白的抑制作用。

图5F：IF检测ML385共处理后NP细胞中FTH1的表达，结果与Western blot相似。

图5G-H：检测不同处理下NP细胞脂质过氧化水平，TBHP或RSL3单独处理诱导脂质过氧化，EXOs显著抑制，但ML385预处理可逆转这种抑制作用。

图5I：验证p62敲低效果。

图5J：Western blot分析p62敲低后NP细胞中NRF2、KEAP1和p62蛋白水平变化，p62敲低逆转了EXOs对KEAP1表达的抑制作用和对NRF2的激活作用。

这些结果表明，EXOs可能通过调节p62/KEAP1/NRF2轴减轻NP细胞氧化应激诱导的铁死亡。

 

6、EXOs有效减轻IVDD的进展

 

图6A：X射线图像显示大鼠尾椎间盘穿刺后0、2、4周的高度变化，穿刺诱导的IVDD组椎间盘间隙变窄，EXO处理组和Fer-1处理组部分恢复。

图6B-C：穿刺后2周和4周椎间盘高度指数（DHI）统计分析，结果与X射线图像一致。

图6D：S-O染色显示大鼠尾椎间盘形态，EXO和Fer-1处理改善了细胞结构和形态。

图6E：HE染色显示大鼠尾椎间盘形态，结果与S-O染色相似。

图6F：基于NP形态和细胞结构的IVDD进展组织学评分，EXO和Fer-1处理组评分低于IVDD模型组。

图6G-J：免疫组化染色检测大鼠尾椎间盘组织中MMP13、Col2A和GPX4的表达，IVDD组MMP13表达升高，Col2A表达降低，EXO干预降低MMP13表达，增加Col2A表达，与Fer-1处理效果相似。

图6K-L：免疫组化检测IVDD组织中GPX4的表达，IVDD组NP组织中无GPX4阳性细胞，EXO干预后GPX4表达增加，Fer-1干预效果类似。

图6M-P：IF染色检测大鼠尾椎间盘组织中Col2A和GPX4的表达，结果与免疫组化一致。

这些结果表明，EXOs可抑制IVD组织中的ECM降解，抑制铁死亡，从而减轻IVDD的发生和进展。

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结论

本研究在组织水平发现铁死亡标记物在退变的IVD组织中异常表达；体外实验表明铁死亡参与TBHP诱导的NP细胞死亡，且可被铁死亡抑制剂抑制；EXOs可减轻NP细胞铁死亡，减缓其退变过程，机制与调节p62/KEAP1/NRF2轴有关；在动物模型中，EXOs有效减轻IVDD和铁死亡。综上，铁死亡与IVDD的发展和进展密切相关，EXOs通过p62/KEAP1/NRF2信号通路抑制NP细胞铁死亡，减缓IVDD进展，是IVDD潜在的治疗策略。