脊髓修复“未解之谜”破防！外泌体携miR-5121“潜入”血管细胞，竟靠自噬“复活”屏障？

脊髓损伤（SCI）是一种严重的神经系统疾病，会导致运动、感觉和自主神经功能障碍，严重影响患者的生活质量。SCI后，血脊髓屏障（BSCB）被破坏，引发缺血缺氧，进一步加剧脊髓微环境失衡。A2型星形胶质细胞在缺血缺氧条件下产生，已有研究表明其能促进SCI修复，但A2型星形胶质细胞来源的外泌体（A2-Exos）在SCI中的作用尚未明确。

今天分享的是发表在【J Nanobiotechnology】（IF：10.6）上题为“Exosome-shuttled miR-5121 from A2 astrocytes promotes BSCB repair after traumatic SCI by activating autophagy in vascular endothelial cells”的研究，该研究旨在探讨A2-Exos在SCI修复（尤其是BSCB修复）中的作用，并阐明其潜在机制。

 

研究结果

1、SCI后BSCB损伤及A2星形胶质细胞增多

 

图1A：免疫荧光共染色显示，SCI小鼠损伤部位血管标记物CD31和紧密连接蛋白ZO-1的表达水平显著低于未损伤区域。

图1B-C：EB染料注射实验显示，SCI组损伤部位出现明显的EB渗漏，而假手术组未见渗漏，证实SCI后BSCB破坏。

图1D：免疫荧光染色显示，SCI后损伤部位血管周围星形胶质细胞中A2型星形胶质细胞特异性标记物S100A10高表达。

图1E-F：GEO数据库分析和Westernblot结果显示，SCI后S100A10表达显著增加，在第1天达到峰值并持续至第28天；同时，紧密连接蛋白表达在SCI后急剧下降，至第14天修复完成。

图1G：免疫荧光染色显示，SCI后第1、3、7、14天，S100A10表达随时间推移逐渐增加。

这些结果表明，SCI导致BSCB损伤，同时诱导A2型星形胶质细胞增殖，提示A2型星形胶质细胞可能参与BSCB修复。

 

2、A2-Exos在体内促进运动功能恢复和BSCB重建

图2A-B：尼氏染色显示，A2-Exos处理组在SCI后28天的损伤面积显著小于PBS对照组。

图2C：BMS评分显示，A2-Exos组小鼠的神经功能评分在SCI后各时间点均高于PBS组。

图2D-E：足迹分析和游泳实验显示，A2-Exos组小鼠的下肢运动功能在SCI后28天出现部分恢复，而PBS组未恢复。

图2F-H：EB染料渗漏实验显示，A2-Exos处理组在SCI后7天的EB渗漏量显著减少，荧光显微镜下可见损伤部位染料分布减少。

图2I-K：Westernblot和免疫荧光染色显示，A2-Exos处理组的紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-5）表达显著增加。

这些结果表明，A2-Exos在体内可促进SCI小鼠的运动功能恢复和BSCB完整性修复。

 

3、A2-Exos在体外重建BSCB

图3A-B：Transwell实验和TEER测量显示，A2-Exos处理显著降低bEnd.3内皮细胞的FITC-葡聚糖通透性，并提高TEER值，模拟SCI微环境下的BSCB稳定性增强。

图3C-F：Westernblot和免疫荧光染色显示，A2-Exos处理组的紧密连接蛋白表达显著增加，而外泌体抑制剂GW4869可部分逆转这些效应。

这些结果表明，A2-Exos在体外可通过增强紧密连接蛋白表达和降低内皮细胞通透性来促进BSCB修复。

 

4、miR-5121在体内促进BSCB恢复

图4A-B：EB染料渗漏实验显示，miR-5121过表达（miR-5121OE）的A2-Exos处理组在SCI后7天的EB渗漏量显著低于阴性对照组，而miR-5121敲低（miR-5121KD）组的渗漏量增加。

图4C：荧光显微镜下，miR-5121OE组的EB染料分布减少，miR-5121KD组分布增多。

图4D-F：免疫荧光染色显示，miR-5121OE组的CD31和ZO-1共表达增加，提示BSCB形成增强；miR-5121KD组则相反。

这些结果表明，A2-Exos中的miR-5121在体内可显著促进BSCB修复。

 

5、miR-5121在体外促进BSCB恢复

图5A-B：TEER测量和FITC-葡聚糖通透性实验显示，miR-5121OE的A2-Exos处理组内皮细胞的TEER值升高、通透性降低，而miR-5121KD组则相反。

图5C-F：Westernblot和免疫荧光染色显示，miR-5121OE组的紧密连接蛋白表达显著增加，miR-5121KD组表达减少。

这些结果表明，miR-5121在体外通过增强紧密连接蛋白表达和内皮细胞屏障功能促进BSCB修复。

 

6、miR-5121通过抑制AKT2促进BSCB修复

图6A-C：体内实验显示，AKT2过表达可增加EB渗漏量，削弱miR-5121OE的保护作用；AKT2敲低则减少渗漏量，逆转miR-5121KD的损伤效应。

图6D：在miR-5121敲低背景下（miR-5121KD-Exos），AKT2敲低（miR-5121KD-Exos+sh-AKT2）可显著减少EB渗漏面积，逆转miR-5121KD导致的BSCB修复缺陷。

图6E：EB渗漏定量显示，miR-5121KD-Exos+sh-AKT2组的渗漏量显著低于miR-5121KD-Exos+sh-NC组（**P<0.0001）。

图6F：荧光显微镜下，miR-5121KD-Exos+sh-AKT2组的染料分布较miR-5121KD-Exos+sh-NC组明显减少，提示AKT2敲低可挽救miR-5121缺失导致的BSCB破坏。

这些结果表明，AKT2过表达会削弱 BSCB 修复，而AKT2敲低则可增强修复能力，且在miR-5121缺失条件下，敲低AKT2仍能部分恢复BSCB完整性。这进一步验证了miR-5121通过抑制 AKT2 介导 BSCB 修复的体内机制。

图7A-H：体外实验显示，AKT2过表达增加内皮细胞通透性、降低TEER值和紧密连接蛋白表达；AKT2敲低则产生相反效果，且能逆转miR-5121KD的负面作用。

这些结果表明，miR-5121通过靶向抑制AKT2发挥促进BSCB修复的作用。

 

7、A2-Exos和miR-5121促进内皮细胞自噬

图8A：mCherry-GFP-LC3荧光染色显示，与对照组（Control）相比，A2-Exos处理组的bEnd.3内皮细胞中自噬体（LC3阳性puncta）数量显著增多；而预先用外泌体抑制剂GW4869处理后，A2-Exos诱导的自噬体数量明显减少。

图8B：LC3荧光强度定量分析表明，A2-Exos组的LC3表达水平显著高于对照组，GW4869预处理则部分逆转了这一效应。

图8C：透射电镜（TEM）观察显示，A2-Exos处理组内皮细胞内可见大量双层膜结构的自噬体，而对照组自噬体数量较少；GW4869预处理后，自噬体数量显著减少。

图8D：自噬体数量定量统计显示，A2-Exos组的自噬体数量显著多于对照组，GW4869组则显著低于A2-Exos组。

图8E-F：Westernblot分析显示，A2-Exos组的自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值显著高于对照组，GW4869预处理则降低了LC3-II/LC3-I比值，表明A2-Exos可激活内皮细胞自噬。

这些结果表明，A2-Exos通过诱导内皮细胞自噬体形成和上调LC3表达，显著增强bEnd.3细胞的自噬活性，且这一效应依赖于外泌体的递送功能。

 

图9A：mCherry-GFP-LC3荧光染色显示，与阴性对照外泌体（miR-NCOE-Exos）相比，miR-5121过表达外泌体（miR-5121OE-Exos）处理的bEnd.3细胞中，自噬体（LC3阳性点状结构）数量显著增多；而miR-5121敲低外泌体（miR-5121KD-Exos）处理组的自噬体数量明显减少。

图9B：LC3荧光强度定量分析表明，miR-5121OE-Exos组的LC3表达水平显著高于miR-NCOE-Exos组，miR-5121KD-Exos组则显著低于miR-NCKD-Exos组。

图9C：透射电镜（TEM）观察显示，miR-5121OE-Exos组内皮细胞内可见大量双层膜结构的自噬体，而miR-5121KD-Exos组的自噬体数量明显减少。

图9D：自噬体数量定量统计显示，miR-5121OE-Exos组的自噬体数量显著多于miR-NCOE-Exos组，miR-5121KD-Exos组则显著低于miR-NCKD-Exos组。

图9E：Westernblot分析显示，miR-5121OE-Exos组的自噬标记蛋白LC3-II/LC3-I比值显著高于miR-NCOE-Exos组，miR-5121KD-Exos组的LC3-II/LC3-I比值则低于miR-NCKD-Exos组。

这些结果表明，miR-5121通过诱导内皮细胞自噬体形成和增强LC3蛋白表达，显著激活bEnd.3细胞的自噬通路，从而促进BSCB修复。miR-5121的促自噬作用是其介导A2-Exos修复BSCB的关键机制之一。

 

8、miR-5121通过AKT2/mTOR/p70S6K通路调控自噬

图10A-F：Westernblot显示，AKT2过表达抑制自噬相关蛋白LC3表达，并激活mTOR/p70S6K通路；AKT2敲低则增强LC3表达，抑制mTOR/p70S6K通路，且miR-5121的效应可被AKT2过表达逆转。

这些结果表明，miR-5121通过抑制AKT2激活自噬，其机制与调控AKT2/mTOR/p70S6K信号通路相关。

 

结论

本研究首次发现A2-Exos通过递送miR-5121促进BSCB修复，其机制为miR-5121靶向抑制AKT2，激活内皮细胞自噬，并调控AKT2/mTOR/p70S6K信号通路。A2-Exos具有易获取、丰度高的特点，为SCI的治疗提供了新的潜在策略。