“外泌体”还能这样研究？广西医科大宁峙彭NUS陈小元AS新作！国自然热点+转录组+实验，14+出文拿捏！

基于无重原子的近红外（NIR）激活的光敏剂在光免疫治疗中具有很大的优势，但肿瘤微环境往往制约其疗效。而一种名为Cy-BF的近红外激活的无重原子光敏剂可解决该问题。

湾湾今天分享的是一篇发表在【Advanced Science】（IF：14.3）上题为“Simultaneous Reversal of T Lymphocytes and Cancer Cells Metabolism Via a Biomimetic Heavy-Atom-Free Photosensitizers-Based Combination Therapies to Boost Cancer Photoimmunotherapy”的研究，该研究一种近红外激活的无重原子光敏剂（命名为 Cy-BF）。随后，采用磷脂和血小板外泌体囊泡对 Cy-BF 进行封装，构建了血小板外泌体囊泡仿生化和 Cy-BF 负载的杂合脂质体（命名为 CHL），并引入一种使用碳酸锂的联合疗法，为未来光免疫治疗的临床应用铺筑道路。

 

研究成果

1. Cy-BF和CHL的制备与表征

图1 Cy-BF和CHL的制备与表征。

图1A：Cy-BF的化学结构公式。

图1B：由Cy-BF的DFT计算确定的均卢米族分布。

图1C：在优化的分子几何形状下简化的单体和二聚体Cy-BF的能级。

图1D-E：CY-BF在CHCl₃中的光致发光（PL）光谱和吸收光谱与PBS溶液中CHL相比，溶液使用760 nm的激发波长。

图1F-G：CL和CHL的TEM图像，包括粒子的放大视图。

图1H：PEV，CL和CHL的颗粒直径和ZETA电位测量值。

图1I：CHL在各种解决方案中的稳定性。

图1J：在暴露于760 nm激光照射下以0.5W/cm²接触的CHL吸收光谱在不同的持续时间内。

图1K：以10 µg ml的Cy-BF浓度在不同制剂（I：肌动蛋白，II：P-链蛋白，III：CD41）中对关键蛋白的蛋白质印迹（WB）分析。

这些结果显示，研究成功合成了CHL，其具有良好的近红外吸收、肿瘤靶向性和光稳定性，为后续的生物学实验奠定了基础。

 

2. CHL的光热能力，活性氧生成和体外抗癌能力

图2 CHL的光热能力。

图2A：含有不同浓度的CY-BF，PBS和滤仿溶液的Chl的加热曲线CY-BF以下760 nm激光照射持续3分钟。

图2B：不同配方的光热循环曲线。

图2C：使用CHL冷却曲线的线性回归计算传热的时间常数。

图2D-F：生产1O²，•OH和•O₂^- 由CHL或CHL+NIR由ESR确定。

图2G-I：SOSG，HPF和DCF后CHL加上760 nm激光照射在不同的时间的荧光光谱。

图2J：用不同组分处理的细胞内ROS的荧光图像和流式细胞仪分析。

这些结果显示，随着浓度的增加，CHL在近红外光下升温更快，CHL具有稳定的光热循环能力和较高的光热转换效率；CHL在760 nm激光照射下可以同时进行I型和II型光动力疗法（PDT；CHL+NIR处理导致ROS增加并改变了4T1细胞的线粒体膜电位。

 

3. CHL的活性氧生成和体外抗癌能力

图3 CHL诱导的线粒体损伤、免疫原性细胞死亡（ICD）及乳酸代谢变化。

图3A：JC-1流式细胞术分析。

图3B：不同成分处理4T1细胞的凋亡检测。

图3C-D：不同剂型处理4T1细胞后HMGB1和CRT的表达和HMGB1的释放。

图3E-F：不同处理后细胞内GSH和乳酸水平。

图3G：不同浓度Cy-BF处理4T1细胞后的相对细胞活力。

这些结果显示CHL+NIR触发的氧化应激可导致4T1细胞ICD。此外，CHL+NIR处理也导致4T1细胞的谷胱甘肽（GSH）和乳酸（LA）水平降低；CCK-8检测证实了CHL+NIR对4T1细胞的细胞毒性作用。

 

图4转录组测序分析CHL介导的基因表达调控。

图4A：治疗后差异表达基因的热图。

图4B：维恩图显示了特定治疗组的基因转录数量。

图4C：火山图说明了差异表达的基因。

图4D：KEGG通路富集分析结果。

图4E：PBS + NIR和CHL + NIR处理4T1细胞凋亡、免疫和氧化应激相关基因表达的热图。

这些结果显示差异基因显著富集于与ICD、ROS和免疫调节相关的信号通路，进一步证明了CHL在免疫增敏治疗中的潜力。

 

图5 CHL介导的树突状细胞（DCs）成熟及T细胞免疫激活。

图5A：体外诱导BMDCs成熟的Transwell系统示意图。

图5B-C：流式细胞术分析和不同处理后成熟BMDCs的定量分析。

图5D-F：成熟BMDCs分泌的TNF-α水平，IL-6水平和IL-12p70水平。

图5G：LC如何促进MCT1从T细胞膜转位到线粒体的示意图。

图5H：用所述制剂处理的CD8+T细胞中的MCT1和COX IV的免疫荧光染色。

图5I：CD8+ T细胞线粒体中MCT1的蛋白质印迹。

图5J：代表体外特异性免疫激活实验装置的示意图。

图5K：ELISA检测LA或LC处理24h后CD8+T细胞上清液中IL-2的水平。

图5L：检测脾脏T淋巴细胞与4T1肿瘤细胞共孵育24h后上清液中LDH水平。

图5M-N：通过流式细胞术分析不同处理后CD8+T细胞中IFN-γ的代表性图和定量。

图5O-P：流式细胞术分析不同处理后CD8+T细胞颗粒酶B（GZMB）的代表性图和定量。

这些结果表明，LC处理后，CD8+T细胞中的MCT1蛋白主要定位于线粒体，不受CHL或LA处理的影响，且联合治疗成功克服了乳酸诱导的T细胞抑制。

 

4. CHL的体内抗肿瘤能力

图6联合治疗可增强肿瘤靶向性。

图6A：4T1荷瘤小鼠注射CL或CHL后不同时间点肿瘤和器官的离体荧光成像和相应强度数据。

图6B：不同治疗后肿瘤组织的红外热成像。

图6C：概述肿瘤接种、纳米药物给药、激光治疗和肿瘤生长监测时间线的示意图。

图6D：治疗后生存曲线。

图6E：每3天测量各组的肿瘤体积。

图6F：在研究结束时记录每种治疗的肿瘤重量。

图6G：不同处理后4T1肿瘤组织中乳酸相对含量。

图6H：治疗后对肿瘤切片进行HE、TUNEL、CRT和Ki-67染色。

图6I：CD8+T细胞中蛋白表达的蛋白质印迹分析示意图。

图6J：Western blot分析CD8+T细胞线粒体中VDAC1和MCT1的表达。

这些结果显示，该治疗可增强肿瘤靶向性，提高光热效应，抑制肿瘤生长，延长生存期，并降低肿瘤乳酸水平及调控CD8+T细胞线粒体相关蛋白表达。

 

图7该治疗可促进淋巴结中DCs成熟。

图7A：流式细胞术数据显示治疗对淋巴结中DCs成熟，4T1肿瘤组织中CD3+ CD8+ T淋巴细胞浸润，CD8+ T细胞中IFN-γ+和GZMB+细胞水平，以及肿瘤组织中CD25+ Foxp3+ Tregs的影响。

图7B：治疗诱导的淋巴结中DC成熟的定量分析。

图7C：4T1肿瘤组织中CD3+ CD8+ T淋巴细胞浸润。

图7D-E：CD8+ T淋巴细胞中IFN-γ+和GZMB+细胞。

图7G：不同处理后血清中促炎细胞因子（TNF-α， IFN-γ和IL-6）的分泌。

图7F：CD4+Foxp3+肿瘤组织中的Tregs。

这些结果显示该治疗可促进淋巴结中DCs成熟，增强肿瘤组织 CD8+T 细胞浸润及IFN-γ和GZMB 介导的免疫响应，并减少Tregs及提高促炎细胞因子水平。

 

图8 CHL的体内抗肿瘤能力。

图8A：4T1双侧肿瘤治疗研究的示意图。

图8B：不同处理后的生存曲线。

图8C-D：原发肿瘤体积的演变和各种治疗后的肿瘤重量。

图8E-F：远处肿瘤体积的发展和不同治疗后的肿瘤重量。

图8G：治疗期间体重的变化。

图8H：不同治疗后远处肿瘤组织的he和CD8染色分析。

图8I：CD8+ T细胞中治疗诱导的IFN-γ+细胞的定量。

图8J-K：不同治疗后血清中促炎细胞因子TNF-α和IFN-γ的水平。

图8L：4T1肿瘤治疗研究的示意图。

图8M：不同治疗后肿瘤组织的乳酸含量。

图8N：不同处理后的生存曲线。

图8O-P：肿瘤体积的变化和不同治疗后的肿瘤重量。

图8Q：不同治疗方式下肿瘤组织的HE和CD8染色分析。

图8R-S：流式细胞术分析和4T1肿瘤组织中CD3+ CD8+ T淋巴细胞浸润的定量。

图8T-U：CD8+ T细胞中治疗诱导的IFN-γ+和GZMB+细胞的数量。

这些结果证实了CHL介导的NIR 摄影疗法（PIT）联合LC能有效延缓原发肿瘤的生长并诱导远隔效应，从而抑制远处肿瘤的生长。

 

结论

综上所述，CHL表现出良好的肿瘤靶向性，在无光环境下毒性最小。CHL联合近红外激光治疗可导致肿瘤细胞线粒体损伤、乳酸降低和免疫原性细胞死亡。此外，CHL减少了肿瘤微环境中的调节性T细胞（Tregs），增加了CD8+T细胞。此外，LC的整合能够转化乳酸，使CD8+T细胞能够利用LA作为能量来源，从而显著提高CHL介导的光免疫治疗的效果。这种联合疗法通过治疗原发肿瘤显著抑制远处肿瘤的生长。