“国自然热点”——外泌体载药再创新！联合巨噬细胞发文，突破8+！创新才是发文动力！

脂肪干细胞（ADSCs）及其分泌的外泌体（Exos）可促进伤口愈合，胸腺素β4（Tβ4）在促进血管生成和减轻炎症方面有重要作用。外泌体（Exos）具有免疫原性低、安全性高、便于储存运输等优势，还能作为药物递送载体。

 

今天分享的是一篇发表在【Mater Today Bio】（IF：8.7）上题为“Tβ4-exosome-loaded hemostatic and antibacterial hydrogel to improve vascular regeneration and modulate macrophage polarization for diabetic wound treatment”的研究，该研究利用外泌体（Exos）的特性，将Tβ4基因导入ADSCs，制备高表达Tβ4的Exos，并开发由透明质酸甲基丙烯酰（HAMA）和聚赖氨酸甲基丙烯酰（PLMA）组成的双光聚合水凝胶，用于Tβ4-Exos的持续释放，以加速糖尿病伤口愈合。

 

研究成果

1.ADSCs，Exos和Tβ4-Exos的特征

图1 ADSCs，Exos和Tβ4-Exos的特征

图1A：倒置相差显微镜下的显微图像。结果显示ADSCs呈特征性纺锤形，具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞的能力。

图1B：流式细胞术检测。结果显示ADSCs表达表面标记CD29和CD44，不表达CD31和CD45。

图1C-D：Western blot检测胸腺素β4 （Tβ4）在ADSCs和Tβ4转导的ADSCs中的表达水平。结果证实Tβ4基因转染效率。

图1E：Western blot分析鉴定外泌体标志物。结果表明Exos和Tβ4-Exos符合外泌体特征，存在阳性标记（CD63、TSG101、CD9），不存在阴性标记钙连蛋白。

图1F：纳米颗粒跟踪分析（NTA）定量外泌体（Exos）和Tβ4-Exos。结果显示Exos和Tβ4-Exos粒径分布峰值约为150nm。

图1G：透射电子显微镜（TEM）提供Exos和Tβ4-Exos的高分辨率图像。结果显示Exos和Tβ4-Exos呈典型球形杯状膜泡形态。

图1H：细胞荧光显微镜图像。结果显示DiI标记的Exos可被人脐静脉内皮细胞（HUVECs）摄取。

这些结果表明，过表达Tβ4不影响Exos的形态、外观和细胞摄取功能。

 

2.HAMA-PLMA（HP）水凝胶的表征和止血性能。

图2 HAMA-PLMA（HP）水凝胶的表征和止血性能。

图2A：透明质酸甲基丙烯酰（HAMA）和多聚赖氨酸甲基丙烯酰（PLMA）的分子结构示意图。

图2B：HAMA-PLMA （HP）水凝胶在HAMA和PLMA混合后形成过程示意图。结果显示HAMA和PLMA混合后在405nm紫外光下10s内可光聚合。

图2C：HP水凝胶可注射性的评估。结果表明HP水凝胶具有良好的可注射性。

图2D：评价HP水凝胶对水流冲击的抵抗力。结果显示HP水凝胶能在强水流冲击30s下仍附着在猪皮上，展现出强抗水流冲击能力。

图2E：检查HP水凝胶的粘附特性。结果显示HP水凝胶对人皮肤、猪皮肤以及小鼠心脏、肺、肾和肝脏的湿润表面具有高粘附性，且无过敏反应和残留。

图2F-H：肝切除止血模型中出血量和止血时间的定量分析。结果显示HP水凝胶和商业止血粉的平均失血量和止血时间均显著低于对照组。

图2I-K：小鼠断尾止血模型中出血量和止血时间定量分析。结果显示HP水凝胶和商业止血粉的平均失血量和止血时间同样显著低于对照组。

这些结果表明，HP水凝胶具有快速光聚合、可注射、强粘附、高止血性能等特点，可作为伤口敷料和Tβ4-Exos的载体。

 

3.HP水凝胶具有优异的Exos缓释能力

图3 HP水凝胶表现出良好的外泌体缓释能力。

图3A-D：体内光学成像实验。结果显示48h后，Gel+Exos组和Gel+Tβ4-Exos组伤口处Exos剩余百分比均高于Exos-only组和Tβ4-Exos组。

图3E-F：体外释放实验。结果显示Gel+Exos组和Gel+Tβ4-Exos组的荧光强度峰值出现时间（约30h）明显晚于Exos-only组（约18h）。

这些结果表明，HP水凝胶能有效实现Exos和Tβ4-Exos的持续释放。

 

4.HP水凝胶的生物相容性

图4 HP水凝胶的生物相容性。

图4A-B：活/死细胞染色实验。结果显示Gel+Exos、Gel+Tβ4-Exos与HUVECs或NIH3T3细胞共培养48h，死细胞的红色荧光极少。

图4C-D：CCK8实验。结果表明不同浓度HP水凝胶对HUVECs和NIH3T3细胞增殖无显著影响。

图4E：血液相容性实验。结果显示无溶血迹象。

图4F：HP水凝胶的溶血率观察。结果显示各浓度下溶血率均低于5%。

图4G：HE染色观察Gel、Gel + Exos、Gel + Tβ4-Exos应用于创面后小鼠心、肝、脾、肺、肾的病理变化。结果显示Gel+Exos和Gel+Tβ4-Exos组小鼠的心、肝、脾、肺、肾组织无明显病理改变。

这些结果表明，HP水凝胶具有良好的细胞相容性、血液相容性和低毒性。

 

5.Tβ4-Exos水凝胶在体内可加速伤口愈合

图5 Tβ4-Exos水凝胶在体内加速创面愈合。

图5A-B：糖尿病伤口建模和治疗方案。

图5C-F：宏观伤口图像显示。结果表明Gel+Tβ4-Exos组伤口愈合效果最明显。

图5G-H：HE染色的组织学图像。结果显示Gel+Tβ4-Exos组剩余伤口长度最短，愈合效果最佳。

图5I-J：Masson三色染色以及伤口区域内胶原蛋白含量的定量分析。结果显示，Gel+Tβ4-Exos组胶原纤维更厚，胶原面积比更大。

这些结果表明，Tβ4-Exos水凝胶能加速糖尿病伤口的愈合。

 

6.Tβ4-Exos水凝胶促进创面血管生成和胶原沉积，减轻创面炎症

图6 Tβ4-Exos水凝胶促进创面血管生成和胶原沉积，减轻创面炎症。

图6A-B：采用激光多普勒成像技术捕捉创面血流并提供相应的定量分析。结果显示，Gel+Tβ4-Exos组伤口区域平均血流强度最高。

图6C-H：组织荧光染色评估新生血管情况，对标记物CD31 （C、D）和α-SMA （E、F）进行成像和定量分析。结果表明，Gel+Tβ4-Exos组血管新生标记物CD31、α-SMA以及增殖标记物KI67的表达均最高。

图6I-M：通过组织荧光染色和定量分析（G和H）评估增殖标志物KI67。通过分别对胶原蛋白I （I和K）和胶原蛋白（I和K）进行荧光染色，评估胶原蛋白I和胶原蛋白III在创面组织中的存在，并进一步进行定量分析。通过组织荧光染色和定量分析IL-6 （N和P）、TNF-α （O和Q）来评估炎症因子。结果显示，Gel+Tβ4-Exos组伤口组织中胶原蛋白I和胶原蛋白III的荧光强度较高，且I/III型胶原蛋白比值较低。

这些结果表明，Tβ4-Exos水凝胶可增强糖尿病伤口的血管生成，促进伤口愈合和胶原蛋白沉积。

 

7.Tβ4-Exos水凝胶通过调控巨噬细胞极化减轻体内外创面炎症

图7体内和体外研究均证实，负载Tβ4-Exos的水凝胶可调节巨噬细胞极化，从而减轻伤口环境中的炎症。

图7A-D：对F4/80和iNOS （M1型巨噬细胞极化的标志物）进行双重免疫荧光染色，并进行后续定量分析。结果显示，Gel+Tβ4-Exos组中M2标记（CD206）与泛巨噬细胞标记（F4/80）的比值最高，M1标记（iNOS）与F4/80的比值最低。

图7E-F：流式细胞术检测M1型巨噬细胞标志物CD86的表达。结果表明，Tβ4-Exos组中M1细胞比例显著低于对照组和Exos组。

图7G：定量聚合酶链反应（q-PCR）检测不同处理组间M1相关标志物。结果显示，Tβ4-Exos处理降低了巨噬细胞向M1表型的极化相关标记物（iNOS、CD86、IL-1β、IL-6、CCR7、TNF-α）的mRNA水平。

这些结果表明，Tβ4-Exos通过调节巨噬细胞极化，上调CD206，下调iNOS、CD86、IL-6、TNF-α等炎症指标，减轻炎症，促进糖尿病伤口愈合。

 

8.Tβ4-Exos在高糖环境下可促进细胞增殖、迁移和血管生成

图8 Tβ4-Exos在高糖条件下促进细胞增殖、迁移和血管生成。

图8A-B：划痕实验评估不同组的迁移能力，并进行定量分析。结果表明Tβ4-Exos显著改善高糖诱导的细胞迁移受损。

图8C-D：EdU检测各组细胞增殖情况并进行定量分析。结果表明高糖条件下Tβ4-Exos处理使EdU阳性细胞比例显著增加。

图8E-F：Transwell迁移实验检测不同组细胞的迁移行为并进行定量分析。结果表明Tβ4-Exos显著增强高糖条件下细胞的迁移能力。

图8G-I：小管形成实验评估血管生成潜能，定量分析各组总分支点和总小管长度。结果表明Tβ4-Exos增加了高糖刺激下的分支点数量和总管长。

这些结果表明，Tβ4-Exos在高糖环境下仍能刺激细胞增殖、迁移和血管生成。

 

9.Tβ4-Exos通过激活PI3K/AKT/mTOR/HIF-1a通路促进血管生成

图9 Tβ4-Exos促进PI3K/AKT/mTOR/HIF-1a通路导致血管生成。

图9A：从转录组测序数据中生成火山图。结果说明了Tβ4-Exos组相对于Exos组的基因差异表达情况。

图9B：进行基因本体论（GO）生物过程富集分析。结果表明，差异表达基因在伤口愈合、细胞迁移、缺氧反应和血管生成等途径显著富集。

图9C：进行京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。结果表明，差异表达基因在HIF-1a信号通路高度富集。

图9D-I：进行蛋白质免疫印迹分析。结果表明，Tβ4-Exos显著提高了PI3K/AKT/mTOR磷酸化蛋白水平和HIF-1a表达。

图9J：示意图展示Tβ4-Exos激活PI3K/AKT/mTOR/HIF-1a信号通路促进内皮细胞增殖、迁移和管形成的机制。

这些结果表明，Tβ4-Exos可能通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1a信号通路促进糖尿病伤口的迁移、增殖和血管生成。

 

结论

本研究开发了一种可注射、止血、抗菌且长效的HAMA-PLMA（HP）水凝胶，用于Tβ4-Exos的持续释放。在模拟糖尿病伤口的微环境中，负载Tβ4-Exos的HP水凝胶能持续作用于伤口表面，通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1a通路促进糖尿病伤口的迁移、增殖、血管生成、胶原蛋白沉积和血管增生，并调节巨噬细胞的M1-M2转化以减轻炎症，最终加速伤口愈合。该治疗模式为糖尿病伤口的管理提供了一种有前景的策略。