IF10+研究，外泌体“硬核带货”小RNA！时间剂量双验证，48h全内化，这技术太顶了！

足细胞损伤是慢性肾病（CKD）的核心病理特征，其结构改变导致80%以上的CKD进展。外泌体作为细胞间通讯载体，在小RNA递送中具有潜力，但传统间接加载方法存在特异性差、效率低等问题。

 

湾湾今天分享的是发表在【J Nanobiotechnology】（IF：10.6）上题为“Efficient delivery of small RNAs to podocytes in vitro by direct exosome transfection”的研究。 该研究开发外泌体直接转染技术，通过荧光标记和功能验证，解析其向足细胞递送小RNA的机制及效果，为CKD治疗提供新方向。

 

研究结果

1、外泌体转染前后的形态与标志物稳定性

图1A：透射电镜观察显示转染前后外泌体均呈典型杯状结构，直径20-30nm，转染后分布更均匀，聚集现象减少。

图1B-C：Western blot分析表明转染前后外泌体均稳定表达CD9和TSG101，定量分析显示蛋白水平无显著差异，定性实验提示转染后CD9信号略增强，可能与纯度提升相关。

这些结果表明，直接转染未破坏外泌体形态及标志物表达，证实该技术对载体结构的兼容性。

 

2、足细胞对外泌体携带小RNA的摄取可视化

图2A：共聚焦显微镜成像分析显示Cy3标记的对照miRNA转染外泌体（Cy3-miRCtrlExos）处理48小时后，足细胞内可见强荧光信号，呈点状或弥散分布；无外泌体对照组（Cy3-miRCtrlw/oExos）仅见极少量非特异性荧光。

图2B：三维投影分析显示xyz和xzy平面显示荧光信号位于细胞质内，与F-肌动蛋白（Phalloidin染色）共定位，提示通过细胞骨架相关通路摄取。

这些结果表明，足细胞可高效摄取外泌体携带的小RNA，且摄取具有特异性。

 

3、流式细胞术量化外泌体摄取效率

图3A：流式细胞分析显示，96.5%的足细胞对Cy3-miRCtrlExos呈阳性反应，而无小RNA转染的外泌体对照组（Exosw/oCy3-miRCtrl）阳性率仅0.15%，未处理组无荧光信号。

图3B：成像流式细胞术分析显示，Cy3-miRCtrlExos处理组可见细胞内明确荧光颗粒，其他组无信号，且各组细胞形态无差异。

这些结果表明，外泌体小RNA递送效率高达96.5%，且对足细胞无形态毒性。

 

4、外泌体摄取机制的分子验证

图4A：CD9共染色分析显示，足细胞内Cy3信号分为两类：CD9阴性和CD9阳性，后者直径200-700nm，符合内吞囊泡特征。

图4B：内吞标志物共定位表明早期内体标志物Rab5与Cy3信号广泛共定位，而晚期内体/溶酶体标志物Rab7共定位较少，表明摄取主要通过早期内吞途径，而非溶酶体降解。

这些结果表明，足细胞通过内吞作用摄取外泌体，且小RNA主要定位于早期内体，提示保留功能活性。

 

5、时间与剂量依赖的摄取动力学

图5A时间依赖性分析表明，处理4小时即可检测到胞内荧光，24小时时细胞内外信号量相近，48小时后细胞外信号显著减少，1周时完全内化，伴随CD9阳性囊泡积累。

图5B：剂量依赖性分析表明，外泌体浓度从18.75µg/孔增至150µg/孔，细胞内荧光强度呈线性增加，证实摄取效率与剂量正相关。

这些结果表明，足细胞对外泌体的摄取具有时间和剂量依赖性，长期培养下可完全内化。

 

6、外泌体递送pre-miR-21的功能活性验证

图6A：cLSM显示，pre-miR-21Exos（无荧光标记）处理组足细胞无Cy3信号，排除非特异性结合；Cy3-miRCtrlExos对照组显示高效内化。

图6B：RT-qPCR检测显示，pre-miR-21Exos处理组成熟miR-21水平较对照组显著升高338倍，证实外泌体递送的pre-miR-21可被加工为功能性成熟miRNA。

这些结果表明，外泌体可有效递送pre-miRNA并诱导靶基因表达上调，验证其在基因调控中的功能活性。

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7、外泌体递送siRNA的基因沉默效应

图7A：免疫荧光染色显示，FilaminA（FlnA）siRNA转染外泌体（FlnA-siRNAExos）处理后，足细胞FlnA蛋白荧光强度显著降低，而对照siRNA组（Cy3-siRNACtrlExos）无变化。

图7B：Western blot定量显示，FlnA-siRNAExos组FlnA蛋白表达量降至对照组的0.36倍，证实特异性基因沉默效应。

这些结果表明，外泌体递送siRNA可高效抑制靶蛋白表达，验证了其在基因编辑中的有效性。

 

结论

本研究首次证实，外泌体直接转染技术可通过内吞途径高效、特异地向足细胞递送小RNA（miRNA/siRNA），且避免溶酶体降解以保留功能活性。体外实验显示，该技术可显著上调成熟miR-21表达，并特异性沉默FlnA等靶基因，为CKD中足细胞损伤的机制研究和靶向治疗提供了新工具。与传统间接加载方法相比，直接转染具有高纯度、低毒性、强特异性及可规模化等优势，有望推动外泌体在肾脏疾病基因治疗中的临床转化。未来需进一步探索其在体内的递送效率及长期安全性，以拓展其应用场景。