“将”还是老的辣！国自然老将——“外泌体”再现风采，10+发文只是冰山一角，科研潜力仍无限，当之无愧的顶流！

脊髓损伤（SCI）是一种严重的神经系统疾病，分为原发性和继发性损伤，继发性损伤由多种病理生理过程引发。血脊髓屏障（BSCB）由星形胶质细胞（分为A1和A2两种表型）、血管内皮细胞和周细胞组成，SCI后BSCB被破坏，会加重脊髓微环境失衡。外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外囊泡，在生理和病理过程中发挥重要作用，但A2星形胶质细胞来源的外泌体（A2-Exos）在SCI修复中的作用及机制尚不明确。

今天分享的是一篇发表在【J Nanobiotechnology】（IF：10.6）上题为“Exosome-shuttled miR-5121 from A2 astrocytes promotes BSCB repair after traumatic SCI by activating autophagy in vascular endothelial cells”的研究，该研究旨在探讨A2-Exos在SCI修复中的作用，特别是在BSCB修复中的作用，并阐明其潜在机制。作者采用GEO数据库分析、western blotting和免疫荧光检测小鼠SCI后A2星形胶质细胞极化，在体外通过缺氧诱导获得A2星形胶质细胞，通过超速离心提取A2-Exos。体内SCI模型和一系列体外实验证明了A2-Exos对SCI后BSCB的修复作用。此外，miRNA测序分析和挽救实验证实了miRNAs在A2-Exos介导的BSCB修复中的作用。最后，进行荧光素酶测定和western blot以研究潜在机制。结果显示，A2-Exos促进SCI后小鼠的运动功能恢复和BSCB修复。在体外，A2-Exos促进了BSCB重建和内皮细胞自噬。miRNA测序确定miR-5121是A2-Exos中富集度最高的miRNA，表明其参与BSCB修复和自噬调节。AKT2被确定为miR-5121的潜在下游靶点。功能获得和失去功能实验进一步验证了miR-5121/AKT2轴。最后，作者证明了AKT2/mTOR/p70S6K通路可能介导A2-Exos中miR-5121对BSCB修复的影响。 

 

研究成果

1.SCI后BSCB受损，A2型星形胶质细胞增多

图1 BSCB破坏和A2星形胶质细胞增殖与SCI相关。

图1A：SCI后第7天CD31和ZO-1的共染色。结果显示SCI后小鼠损伤部位血管标记物CD31和紧密连接蛋白ZO-1的表达水平显著低于未损伤区域。

图1B-C：SCI后第7天注射EB染料后脊髓的代表性图像及EB染料泄漏的定量分析。结果显示SCI损伤部位能明显观察到EB染料，而假手术组没有，证实SCI后BSCB被破坏。

图1D：CD31、GFAP和S100A10的代表性共定位图像。结果显示，SCI后损伤部位血管周围的星形胶质细胞中S100A10（A2星形胶质细胞的特异性标记物）高表达。

图1E：SCI后不同时间点S100A10表达的GEO数据库分析。结果显示SCI后S100A10表达显著增加，在第1天达到峰值，并持续升高至伤后28天。

图1F：在SCI后指定时间点通过蛋白质印迹检查脊髓GFAP、S100A10和紧密连接蛋白（ZO-1、Occludin、Claudin-5）的表达水平。结果显示，SCI后S100A10表达增加，同时紧密连接蛋白表达急剧下降，BSCB修复在伤后14天完成。

图1G：SCI后第1天、第3天、第7天和第14天GFAP和S100A10共染色的荧光图像。结果进一步证实SCI后第1、3、7和14天S100A10表达增加。

这些结果表明，SCI导致小鼠BSCB受损，同时A2星形胶质细胞增多。

 

2.A2-Exos可防止SCI诱导的脊髓损伤并在体内重建BSCB完整性

图2 A2-Exos促进体内运动功能恢复和BSCB重建。

图2A-B：脊髓组织在SCI后第14天进行尼氏染色及SCI病变区域的定量分析。结果显示，SCI后28天，A2-Exos处理组的损伤面积明显减小。

图2C：小鼠在SCI后第0天、第3天、第7天、第14天和第28天的BMS评分。结果显示A2-Exos组小鼠在SCI后的评分高于PBS对照组。

图2D：小鼠在SCI后第28天的足迹测试。结果显示，PBS组小鼠在伤后28天下肢运动功能未恢复，而A2-Exos组有部分恢复。

图2E：小鼠在SCI后第28天的游泳试验。结果显示A2-Exos组小鼠身体角度更倾斜，尾巴更下垂。

图2F-H：EB染料注射实验。结果显示，A2-Exos处理减少了SCI后7天的EB渗漏。

图2I-J：Western blot分析。结果显示，A2-Exos处理后紧密连接蛋白表达显著增加。

图2K：免疫荧光分析。结果表明，A2-Exos处理促进了SCI后7天BSCB的恢复。

这些结果表明，A2-Exos能保护脊髓免受SCI损伤，并促进体内BSCB完整性的恢复。

 

3. A2-Exos体外重建BSCB

图3 A2-Exos促进BSCB在体外的恢复。

图3A：测量TEER值以评估bEnd.3内皮细胞的屏障功能。结果显示A2-Exos显著降低了bEnd.3内皮细胞中FITC-葡聚糖的通透性。

图3B：进行FITC-葡聚糖通透性测定，以评估bEnd.3内皮细胞的屏障功能。结果显示A2-Exos增加了bEnd.3细胞的跨上皮电阻（TEER）值。

图3C-D：通过western blot分析检测紧密连接（TJ）蛋白的表达水平，对TJ蛋白表达进行定量分析。结果显示，A2-Exos处理后紧密连接蛋白表达增加。

图3E-F：TJ蛋白的免疫荧光图像及定量分析。结果显示A2-Exos处理后紧密连接蛋白表达增加，外泌体抑制剂GW4869预处理后A2-Exos能够部分逆转。

这些结果表明，A2-Exos在体外能促进BSCB的恢复。

 

4. miR-5121促进体内BSCB的恢复

图4 miR-5121促进体内BSCB恢复。

图4A-B：SCI后第7天注射EB染料后脊髓的代表性图像及EB染料泄漏的定量分析。结果显示，miR-5121过表达（miR-5121 OE）组在SCI后7天的染料渗漏减少，而miR-5121敲低（miR-5121 KD）组染料渗漏明显。

图4C：荧光显微镜下的EB染料分布结果证实了上述发现。

图4D-F：小鼠SCI后第7天CD31和ZO-1的免疫荧光共染色。结果显示，miR-5121 OE组促进了BSCB的形成，而miR-5121KD组则相反。

这些结果表明，miR-5121有助于体内BSCB的恢复。

 

5. miR-5121可促进体外BSCB的恢复

图5 miR-5121促进BSCB体外恢复。

图5A：测量TEER值以评估指定组中bEnd.3内皮细胞的屏障功能。结果显示miR-5121 OE组的bEnd.3内皮细胞通透性显著降低，miR-5121 KD组则相对较高。

图5B：进行FITC-葡聚糖通透性测定以评估指定组中bEnd.3内皮细胞的屏障功能。结果显示miR-5121 OE组增强了TEER，miR-5121 KD组则降低了TEER。

图5C-D：Western blot分析。结果显示，miR-5121 OE组紧密连接蛋白表达增加，miR-5121 KD组则减少。

图5E-F：免疫荧光染色。结果与Western blot分析一致。

这些结果表明，miR-5121在体外对BSCB的恢复起促进作用。

 

6. A2-Exos分泌的miR-5121通过抑制AKT2在体内促进BSCB修复

图6 A2-Exos分泌的miR-5121通过在体内抑制AKT2促进BSCB修复。

图6A-C：EB染色实验。结果显示，体内实验中，AKT2过表达增加了EB染料渗漏，削弱了miR5121OE对BSCB的保护作用；而AKT2敲低则减少了染料渗漏，减轻了miR5121KD对BSCB的损害。

图6D-F：EB染色实验分析。结果与上述一致，进一步验证了miR-5121通过抑制AKT2促进体内BSCB修复。

这些结果表明，A2-Exos分泌的miR-5121通过抑制AKT2促进体内BSCB修复。

 

7. A2-Exos分泌的miR-5121通过抑制AKT2促进体外BSCB修复

图7 A2-Exos分泌的miR-5121通过在体外抑制AKT2促进BSCB修复。

图7A、E：通透性实验。结果显示AKT2过表达组的内皮细胞通透性较高，AKT2敲低组则较低。

图7B、F：FITC-葡聚糖通透性测定。结果显示AKT2过表达导致TEER值降低，AKT2敲低则使TEER值升高。

图7C、G：免疫荧光分析。结果显示，AKT2过表达组紧密连接蛋白表达减少，AKT2敲低组则增加。

图7D、H：Western blot分析。结果与免疫荧光分析一致。

这些结果表明，A2-Exos分泌的miR-5121通过抑制AKT2促进体外BSCB修复。

 

8. A2-Exos在体外促进bEnd.3细胞的自噬

图8 A2-Exos促进bEnd.3内皮细胞的自噬。

图8A-B：转染mCherry-GFP-LC3病毒实验。结果显示A2-Exos组bEnd.3内皮细胞的自噬活性显著增强，GW4869处理部分逆转了这一效果。

图8C：透射电镜（TEM）成像。结果显示，A2-Exos处理后自噬体数量增加，GW4869预处理的结果与荧光染色趋势一致。

图8D-E：Western blot分析。显示，A2-Exos处理后自噬标记蛋白LC3的表达增加。

这些结果表明，A2-Exos能促进bEnd.3细胞的体外自噬。

 

9. miR-5121促进bEnd.3内皮细胞自噬

图9 miR-5121促进bEnd.3内皮细胞的自噬。

图9A-B：转染mCherry-GFP-LC3病毒实验。结果显示，miR-5121 OE组增强了bEnd.3内皮细胞的自噬，miR-5121 KD组则抑制了自噬。

图9C：TEM成像。结果显示，miR-5121 OE组的自噬体数量比对照组增加，miR-5121 KD组则相反。

图9D-E：Western blot分析。结果显示，miR-5121 OE组LC3表达增加，进一步证实了miR-5121对内皮细胞自噬的正向调节作用。

这些结果表明，A2-Exos通过传递miR-5121促进bEnd.3内皮细胞的自噬。

 

10. A2-Exos分泌的miR-5121靶向AKT2并通过AKT2/mTOR/p70S6K信号通路调节bEnd.3内皮细胞自噬

图10 A2-Exos分泌的miR-5121靶向AKT2，并通过AKT2/mTOR/p70S6K信号通路调节bEnd.3内皮细胞中的自噬。

图10A、D：mCherry-GFP-LC3荧光染色。结果显示，AKT2过表达使bEnd.3内皮细胞中LC3表达降低，AKT2敲低则使LC3表达增加。

图10B、E：TEM成像。结果进一步显示了自噬体的存在情况，与LC3表达变化趋势一致。

图10C、F：Western blot分析。结果表明，AKT2对其下游靶点有抑制作用，证实了AKT2通过AKT2/mTOR/p70S6K途径调节自噬。

这些结果表明，miR-5121通过抑制AKT2，激活AKT2/mTOR/p70S6K信号通路，促进bEnd.3内皮细胞自噬，进而促进BSCB修复。

 

结论

该研究首次证明A2-Exos具有神经保护作用，能促进BSCB修复。A2-Exos分泌的miR-5121通过调节自噬，可能经由AKT2/mTOR/p70S6K通路促进BSCB修复。