还在为MPN靶向难发愁？看双修饰外泌体如何带着抑制剂在骨髓 “开绿灯”，这思路能直接套实验！

骨髓增殖性肿瘤（MPNs）是一组以成熟髓系细胞过度生成为特征的克隆性造血干细胞疾病，主要由JAK2、CALR等基因突变驱动JAK/STAT通路过度激活所致。现有治疗（如羟基脲、芦可替尼）仅能缓解症状，无法清除恶性克隆，且存在耐药、全身毒性等问题。骨髓微环境的复杂性及药物靶向递送障碍进一步加剧治疗难度。

湾湾今天分享的是发表在【Journal of Nanobiotechnology】上题为“USP5 inhibition via bone marrow-targeted engineered exosomes for myeloproliferative neoplasms therapy”的研究。研究发现，去泛素化酶USP5在JAK2V617F突变的间充质干细胞（Mut-MSCs）中高表达，通过抑制Caspase3介导的凋亡促进细胞异常增殖，是MPNs进展的关键调控因子。为靶向递送USP5抑制剂（USP5-IN-1），本研究构建了共表达CXCR4和P-选择素靶向肽（PSN）的工程化外泌体（USP5@Exosome-CP），实现骨髓特异性递送，旨在提升MPNs治疗效果并减少脱靶效应。

 

研究结果

1.MPN小鼠模型中调控MSC增殖的去泛素化酶筛选

图1A：实验流程示意图。通过CD117磁珠分选正常小鼠和JAK2V617F突变小鼠骨髓中的MSCs，提取mRNA并逆转录为cDNA，利用含86种去泛素化酶的引物库进行QPCR筛选。

图1B：QPCR结果显示，与正常MSCs相比，Mut-MSCs中USP5和USP8的mRNA表达显著上调，而USP13、USP42、USP51显著下调。

图1C：Western blot验证显示，USP5、USP8蛋白在Mut-MSCs中高表达，USP13、USP42、USP51低表达，与mRNA水平一致。

图1D：Western blot显示，Mut-MSCs中Caspase3表达低于正常MSCs；敲低USP5或USP8可显著上调Caspase3，而过表达USP13、USP42、USP51对其无影响。

图1E：流式细胞术显示，敲低USP5或USP8可显著抑制Mut-MSCs增殖，而过表达USP13、USP42、USP51仅轻微抑制。

图1F-G：USP5敲除（sgUSP5）后，Mut-MSCs中癌基因（如Idh2、Slc6a2）下调，抑癌基因（如Ptpn2、Runx3）上调（火山图及热图）。

图1H-I：KEGG和GSEA分析显示，sgUSP5组凋亡通路、细胞分化、细胞周期负调控等通路富集。

图1J：流式细胞术显示，sgUSP5组Annexin V阳性细胞比例显著高于对照组，提示凋亡增加。

这些结果表明，USP5是调控Mut-MSCs异常增殖的关键去泛素化酶，其通过抑制Caspase3介导的凋亡促进细胞存活，是MPNs的潜在治疗靶点。

 

2.USP5表达与急性髓系白血病（AML）患者疾病进展的关联分析

图2A：TCGA数据库分析显示，USP5 mRNA在AML患者中高表达。

图2B：不同FAB分型（M1-M6）的AML患者中均存在USP5高表达。

图2C：生存分析显示，USP5高表达的AML患者总生存期显著短于低表达患者。

图2D-E：USP5高表达与肿瘤微环境中PD-L1、PD-1等免疫抑制分子高表达及髓系抑制细胞、调节性T细胞浸润增加显著相关。

图2F-G：单细胞数据分析显示，USP5主要在高表达CD34、CD117的MSCs中表达。

这些结果表明，USP5高表达与myeloid恶性肿瘤（包括AML）的进展、免疫抑制微环境及不良预后相关，提示其在myeloid肿瘤中的广泛调控作用。

 

3.USP5@Exosome-CP的制备与表征

图3A-C：免疫组化、共聚焦及流式细胞术显示，MPN模型小鼠骨髓血管内皮细胞（BMEC）中P-选择素表达显著高于正常小鼠，TNF-α刺激可进一步上调。

图3D-E：多细胞因子检测及ELISA显示，MPN小鼠骨髓中CXCL12表达最高，且Mut-MSCs分泌的CXCL12显著高于正常MSCs。

图3F：外泌体制备流程。通过基因工程使MSCs表达Lamp2b-CXCR4融合蛋白，再通过CP05-PSN肽（靶向CD63和P-选择素）修饰，电穿孔装载USP5-IN-1。

图3G：流式细胞术显示，当CP肽与外泌体蛋白质量比为2:5时，外泌体表面荧光饱和，装载效率最高。

图3H-I：电穿孔参数优化显示，500V、500μF时USP5-IN-1装载量最高；HPLC证实USP5@Exosome-CP中药物保留化学特性。

图3J-K：Zeta电位显示修饰后外泌体电荷无显著变化；DLS和TEM显示其粒径约100-200nm，符合外泌体特征。

图3L：Western blot验证外泌体表达CD63、CD81等标志物及CXCR4。

这些结果表明，USP5@Exosome-CP可通过CXCR4和P-选择素靶向肽实现骨髓靶向，高效装载USP5-IN-1且保留外泌体固有特性。

 

4.USP5@Exosome-CP对炎症BMEC和Mut-MSCs的靶向性

图4A-B：共聚焦及流式细胞术显示，Exosome-P（P-选择素靶向）对炎症BMEC（TNF-α刺激）的摄取效率显著高于正常BMEC；Exosome-CP（双靶向）摄取效率最高。

图4C-D：共聚焦及流式细胞术显示，Exosome-C（CXCR4修饰）对Mut-MSCs的靶向效率显著高于正常MSCs；Exosome-CP靶向性更强。

图4E-G：Transwell模型显示，Exosome-CP穿过炎症BMEC后对Mut-MSCs的靶向效率（MFI）是Exosome-C和Exosome-P的5倍。

这些结果表明，双靶向修饰的Exosome-CP可高效穿透炎症BMEC屏障并特异性靶向Mut-MSCs，为骨髓靶向递送奠定基础。

 

5.USP5@Exosome-CP在MPN模型小鼠中的生物分布

图5A：生物发光成像证实成功构建luciferase标记的MPN模型。

图5B-D：荧光成像显示，USP5@Exosome-CP在骨髓的积累量显著高于未修饰外泌体，12h达峰，荧光强度是未修饰组的2.2倍。

图5E：器官分布显示，外泌体主要积累于肝、脾，USP5@Exosome-CP在骨髓中特异性富集。

图5F：免疫荧光显示，USP5@Exosome-CP与骨髓中c-kit+Mut-MSCs共定位显著。

这些结果表明，USP5@Exosome-CP可高效靶向MPN小鼠骨髓并与Mut-MSCs特异性结合，实现药物的精准递送。

 

6.USP5@Exosome-CP在MPN模型中的治疗效果

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图6A-B：实验设计。MPN模型小鼠尾静脉注射USP5@Exosome-CP（5mg/kg USP5-IN-1），每3天1次，共5次。

图6C-D：生物发光及流式细胞术显示，USP5@Exosome-CP组肿瘤负荷显著降低，Mut-MSCs数量减少4.7%（对照组42.1%）。

图6E：生存分析显示，USP5@Exosome-CP组80天生存率为30%，显著高于其他组。

图6F-G：免疫组化显示骨髓中c-kit+细胞减少；H&E染色证实各器官无明显病理损伤。

这些结果表明，USP5@Exosome-CP可显著抑制MPN进展，延长生存期且无明显毒性，具有良好治疗效果。

 

结论

本研究证实USP5是MPNs中调控Mut-MSCs异常增殖的关键靶点，其通过抑制Caspase3凋亡促进疾病进展。构建的双靶向工程化外泌体（USP5@Exosome-CP）可通过CXCR4/CXCL12和P-选择素/P-选择素轴高效靶向骨髓，实现USP5-IN-1的精准递送。

该系统在MPN模型中显著抑制Mut-MSCs增殖，减少肿瘤负荷，延长生存期，且全身毒性低。这一策略不仅验证了USP5作为MPNs治疗靶点的价值，还为骨髓微环境靶向治疗提供了新范式。