外泌体介导的miR-224-5p信号轴，细胞互作研究发分密码曝光！IF：14+高分思路，还不快快学起来？

心房颤动（AF）是全球高发的心律失常，现有治疗（如射频消融、抗心律失常药物）复发率高（50%-63%），且放疗会导致神经认知缺陷。心房成纤维细胞（ACFs）与心房肌细胞（ACMs）的旁分泌通讯在AF发生中起关键作用，而细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的重要载体，其cargo（如miRNA）可能参与AF的病理过程。

今天分享的是发表在【Advancedscience】（IF：14.1）上题为“Atrial Fibroblasts-Derived Extracellular Vesicles Exacerbate Atrial Arrhythmogenesis”的研究，本研究旨在探索ACFs来源的EVs如何通过调控miRNA影响AF发生，重点关注miR-224-5p对靶基因CACNA1C（编码L型钙通道Cav1.2）的作用及机制。

 

研究结果

1.AngII处理的心房成纤维细胞（ACFs）分泌的EVs促进心房颤动（AF）发生

图1A：透射电镜（TEM）显示，人ACFs分泌的EVs呈典型囊泡结构，对照组（Exo-Ctl）与AngII处理组（Exo-AngII）形态无显著差异。

图1B：纳米颗粒跟踪分析（NTA）显示，EVs粒径主要分布在30-150nm，两组粒径范围一致。

图1C-D：Western blot检测显示，EVs中高表达标志物Alix和CD81，而胞质裂解物中不表达，证实EVs纯度。

图1E：实验设计：培养人ACFs，AngII处理后提取EVs，尾静脉注射到大鼠体内，检测心脏电生理指标。

图1F-G：心内电生理检测显示，Exo-AngII组大鼠起搏诱导AF的发生率（85.7%）显著高于Exo-Ctl组。

图1H：Exo-AngII组AF持续时间显著长于Exo-Ctl组。

图1I：Exo-AngII组心房有效不应期（AERP）显著缩短。

图1J：两组左心房面积无显著差异，提示AF易感性增加不依赖结构重构。

这些结果表明，AngII诱导的ACFs分泌的EVs可增加AF易感性，表现为AF发生率升高、持续时间延长及AERP缩短，且不依赖心房结构改变。

 

2.ACFs来源的EVs中miR-224-5p是促进AF的关键分子

图2A-C：敲低ACFs中Dicer（抑制miRNA生成）后，其分泌的EVs（Exo-siDicer+AngII）可降低AF发生率，缩短AF持续时间。

图2D-E：miRNA测序显示，AngII处理的大鼠ACFs及其EVs中miR-224-5p显著上调（热图）。

图2F-G：qRT-PCR验证，AngII处理的大鼠ACFs及其EVs中miR-224-5p表达显著升高，而敲低Dicer可逆转。

图2H-J：ACMs中miR-224-5p基础水平显著低于ACFs，且AngII处理不影响ACMs中该miRNA水平。

图2K：与ACFs-EVs共培养后，ACMs中miR-224-5p水平显著升高，且AngII处理的EVs诱导更显著。

这些结果表明，miR-224-5p在AngII诱导的ACFs及其EVs中高表达，且可通过EVs传递至ACMs，是介导EVs促AF作用的关键miRNA。

 

3.大鼠ACFs来源的EVs中miR-224-5p加剧AF易感性

图3A-B：miR-224-5p mimic转染ACFs后，细胞及EVs中该miRNA水平显著升高。

图3C：PKH-26标记的EVs可被大鼠心房组织摄取（WGA染色显示心肌细胞）。

图3D-F：注射miR-224-5p模拟物处理的ACFs-EVs（Exo-Mimic）的大鼠，AF发生率（100%）显著高于对照组（Exo-NC，25%，p=0.007），AF持续时间延长。

图3G-H：miR-224-5p抑制剂转染ACFs后，细胞及EVs中该miRNA水平显著降低。

图3I-K：注射AngII+抑制剂处理的ACFs-EVs（Exo-Inhibitor+AngII）的大鼠，AF发生率（25%）显著低于Exo-AngII组，AF持续时间缩短。

这些结果表明，ACFs-EVs中的miR-224-5p可剂量依赖性地调节AF易感性，过表达促进AF，抑制则缓解。

 

4.miR-224-5p通过缩短动作电位时程（APD）促进AF

图4A：实验设计示意图。SD大鼠分别尾静脉注射阴性对照（NC）或miR-224-5p激动剂（agomiR-224-5p），每隔1天注射1次，共3次，随后进行心内电生理检测。

图4B：原位杂交显示，agomiR-224-5p处理组大鼠心房组织中miR-224-5p（红色荧光）表达显著高于NC组。

图4C：代表性心电图（导联I）和心内电图显示，agomiR-224-5p组大鼠在程序性刺激后出现房颤（AF），而NC组维持窦性心律（SR）。

图4D：agomiR-224-5p组房颤发生率（87.5%，7/8）显著高于NC组。

图4E：agomiR-224-5p组房颤持续时间显著长于NC组。

图4F：agomiR-224-5p组大鼠心房有效不应期（AERP）显著短于NC组。

图4G：膜片钳记录显示，agomiR-224-5p组分离的心房肌细胞（ACMs）动作电位时程（APD）缩短，其中APD50（50%复极化时程）显著降低。

图4H：另一实验设计示意图：SD大鼠分别尾静脉注射NC或miR-224-5p拮抗剂（antagomiR-224-5p），共3次，1周后在乙酰胆碱（Ach）诱导下进行心内电生理检测。

图4I：原位杂交显示，antagomiR-224-5p处理组大鼠心房组织中miR-224-5p（红色荧光）表达显著低于NC组。

图4J：代表性心电图显示，NC+Ach组大鼠出现房颤，而antagomiR-224-5p+Ach组维持窦性心律。

图4K：antagomiR-224-5p+Ach组房颤发生率（14.3%，1/7）显著低于NC+Ach组。

图4L：antagomiR-224-5p+Ach组房颤持续时间显著短于NC+Ach组。

图4M：antagomiR-224-5p+Ach组大鼠AERP显著长于NC+Ach组。

图4N：膜片钳记录显示，antagomiR-224-5p组ACMs的APD50较NC组轻度延长。

这些结果表明，miR-224-5p可通过缩短心房肌细胞动作电位时程（APD）和心房有效不应期（AERP），增加房颤易感性；而抑制miR-224-5p可逆转上述电生理异常，降低房颤发生率并缩短持续时间，证实其在心房电重构中的关键作用。

 

5.miR-224-5p直接靶向CACNA1C抑制L型钙电流（I_Ca,L）

图5A-B：mRNA测序及GO分析显示，antagomiR处理的大鼠心房中差异基因富集于钙信号通路。

图5C：双荧光素酶报告基因实验显示，miR-224-5p模拟物显著降低野生型CACNA1C的luciferase活性，对突变型无影响，证实直接结合。

图5D：RNA pull down实验显示，生物素标记的miR-224-5p可富集CACNA1CmRNA。

图5E-F：agomiR处理的大鼠心房中Cav1.2（CACNA1C编码蛋白）水平降低，ACMs的I_Ca,L电流减小。

图5G-H：antagomiR处理的大鼠心房中Cav1.2水平升高，ACMs的I_Ca,L电流增大。

这些结果表明，miR-224-5p直接靶向CACNA1C，抑制其表达及I_Ca,L电流，是导致APD缩短的分子机制。

 

6.成纤维细胞特异性miR-224-5p敲入（FMKI）小鼠AF易感性增加

图6A-C：FMKI小鼠AF发生率（87.5%）显著高于野生型，AF持续时间延长。

图6D-E：FMKI小鼠ACMs的APD50显著缩短。

图6F-G：FMKI小鼠ACMs的I_Ca,L电流显著减小。

图6H-I：FMKI小鼠ACMs中Cav1.2表达显著降低。

图6J-L：FMKI小鼠注射AAV9-miR-224-5p海绵后，AF发生率（14.3%）显著低于对照组（75%，p=0.0406），AF持续时间缩短。

这些结果表明，成纤维细胞特异性过表达miR-224-5p可通过降低Cav1.2和I_Ca,L，增加AF易感性，而抑制该miRNA可缓解。

 

7.敲低成纤维细胞miR-224-5p减轻Crem小鼠自发性AF

图7A：实验设计：Crem转基因小鼠（自发性AF模型）注射AAV9-shmiR-224-5p，检测AF表型。

图7B-D：Crem小鼠自发性AF发生率（85.7%）显著高于WT，注射AAV9后发生率降至37.5%，AF持续时间缩短。

图7E：Crem小鼠ACFs及其EVs中miR-224-5p水平升高，注射AAV9后降低。

图7F-J：Crem小鼠左心房面积增大、LVEF降低，Cav1.2表达降低，注射AAV9后部分逆转。

这些结果表明，敲低成纤维细胞miR-224-5p可减轻自发性AF模型的AF表型，改善心房电重构。

 

8.AF患者血浆EVs中miR-224-5p升高且促进大鼠AF

图8A：免疫荧光显示，AF患者心房成纤维细胞中miR-224-5p水平高于窦性心律（SR）患者。

图8B-C：qRT-PCR显示，AF患者ACFs、ACFs-EVs及血浆EVs中miR-224-5p水平显著升高，miR-224-3p无差异。

图8D：实验设计。将SR/AF患者血浆EVs注射到大鼠体内，检测AF易感性。

图8E-G：AF患者EVs（Exo-AF）处理的大鼠AF发生率（100%）显著高于SR组，AF持续时间延长。

图8H-I：AF患者血浆EVs中miR-224-5p水平显著高于SR患者，且持续性AF患者高于阵发性AF。

这些结果表明，AF患者血浆EVs中miR-224-5p水平升高，且可加剧大鼠AF易感性，提示其作为AF生物标志物的潜力。

 

结论

本研究证实，心房成纤维细胞（ACFs）在AngII刺激下分泌的EVs富含miR-224-5p，该miRNA通过直接靶向CACNA1C抑制L型钙电流（I_Ca,L），缩短心房肌细胞动作电位时程（APD）和心房有效不应期（AERP），导致心房电重构，增加AF易感性。成纤维细胞特异性过表达miR-224-5p可加剧AF，而抑制该miRNA可缓解多种AF模型的病理表型。此外，AF患者血浆EVs中miR-224-5p水平升高，且与疾病进展及射频消融后复发相关。这些发现揭示了ACFs-EVs-miR-224-5p-CACNA1C轴在AF发生中的关键作用，为AF的诊断和治疗提供了新靶点。