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公司新闻/正文
间充质干细胞来源的外泌体通过诱导自噬修复帕金森病模型
1124 人阅读发布时间：2020-05-11 15:31
文献链接：https://doi.org/10.1038/s41419-020-2473-5
患病率逐年增加的帕金森病（PD）是一种进行性神经变性疾病，研究表明人脐带间充质干细胞（hucMSC）因具神经保护作用，对PD具备治疗效果，但其不可控制的分化及低存活于宿主体内限制了其应用，迫切需要具有类似修复作用的替代hucMSCs移植的替代方法。由河北医科大学第一医院于2020年4月在《Cell Death & Disease》(IF：5.959）上发表了论文“Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson’s disease model by inducing autophagy” ,对hucMSC分泌的Exos是否可以代替hucMSC发挥作用作了探讨。
研究结果：
1. hucMSC细胞分离培养鉴定
利用组织块贴壁方法从人脐带中分离出hucMSC细胞，呈现多边形或纺锤形生长（图1a）。生长的第二天，细胞即可进入对数生长期。第三天，由于更换培养基，生长速度减慢，但第二天又迅速增加，表现出强大的自我更新和繁殖能力（图1b）。FCM分析P3代细胞，其高表达干细胞标志物CD90、CD105和CD73，血细胞标志物CD34、CD45和HLA-DR为阴性表达（图1c）。另细胞能在诱导培养基的作用下分化为软骨细胞、成骨及成脂（图1d）。
因此，该细胞为hucMSC细胞，可用于后续实验。
图1 hucMSC的鉴定
图2 6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞活力
3.hucMSCs逆转6-OHDA抑制的SH-SY5Y细胞增殖，且Exos参与该过程
作者建立hucMSC与6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞共培养体系（图3a），分为5组：对照组，6-OHDA组，6-OHDA + GW4869组，6-OHDA + hucMSCs组和6-OHDA + hucMSCs + GW4869组。hucMSCs逆转6-OHDA抑制的SH -SY5Y细胞增殖，同时GW4869可衰减这种作用（图3b）。该阻止细胞直接接触和大囊泡转移的体系表明了Exos可能参与了hucMSC逆转6-OHDA造成的SH-SY5Y细胞活力降低的过程。
图3 Exos功能及鉴定
3.hucMSCs-Exos鉴定及被SH-SY5Y摄取
超速离心提取hucMSCs在无血清培养基中培养48hrs后上清液中的Exos，TEM 、NTA和Western blot对其进行鉴定（图3b）。另借助IF实验证明PKH26-Exos能成功被SH-SY5Y细胞摄取（图3c）。
4.Exos增强SH-SY5Y细胞活力并减少6-OHDA诱导的凋亡
将SH-SY5Y细胞与不同浓度的Exos共培养12 hrs，再用6-OHDA处理，Exos以剂量依赖方式促细胞增殖，在40ug/ml是显著增强（P < 0.05）（图4a）。另Western blot结果显示，与6-OHDA组相比，剪切后的Caspase3在6-OHDA+Exos组中显著降低（图4b），细胞凋亡亦减少（图4c），表明Exos可降低6-OHDA诱导的细胞凋亡作用。
图4 Exos促SH-SY5Y细胞存活抑制凋亡
5. Exos增加6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞自噬水平
为探究Exos是否诱导自噬，作者借助WB分析6-OHDA + Exos组LC3B-II / I和Beclin-1的表达显著增强，而P62的表达下降（图5a）。自噬体与溶酶体融化抑制剂Baf-A1的使用使LC3B-II / I，Beclin-1和p62的水平明显更高，表明Exos激活6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞发生自噬。
GFP-RFP-LC3转染细胞中，用共聚焦显微镜观察自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）发现，Exos处理增加黄色和红色斑点的数量，Baf-A1在不影响Exos引起的红色斑点数量情况下，进一步增加黄色斑点的数量（图5b），TEM亦证明这一结果（图5c）。
表明由Exos诱导的自噬增加可能为6-OHDA刺激的细胞凋亡提供保护作用。
图5 Exos增加6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞自噬的水平
6.Exos可穿过BBB到达脑黑质（SN），缓解PD模型中的不对称旋转
按图6a处理方式，对PD模型鼠给予盐水和Exos处理后，发现Exos能与SN中多巴胺能神经元（TH：酪氨酸羟化酶）共定位（图6b）。另与6-OHDA +盐水组相比，给Exos处理的鼠随着时间的推移，不对称旋转行为明显减少（图6c）。表明，Exos可以穿越BBB并到达SN，进而改善PD模型鼠的行为缺陷。
图6 Exos在脑组织SN中的积累并改善PD模型的行为缺陷
7.Exos显著减少PD模型的SN多巴胺能神经元损失
对SN进行HE染色分析，6-OHDA +盐水组细胞间隙中出现收缩，表现不同程度的变性和坏死性，IHC分析TH表明，6-OHDA +盐水组的手术侧表现多巴胺能神经元的减少。而Exos在一定程度上的抑制6-OHDA的作用（图7b、c），表现出对SN多巴胺能神经元的保护作用。
图7 Exos减少PD大鼠模型中SN多巴胺能神经元的丢失和凋亡
8.Exos降低PD大鼠模型中TUNEL + / TH +细胞的数量
如图7d所示，与6-OHDA +盐水组相比， 6-OHDA + Exos组中TUNEL + / TH +细胞的数量明显减少。表明Exos可保护多巴胺能神经元免受6-OHDA刺激。
9. Exos上调PD大鼠纹状体中多巴胺及其代谢物的水平
图 8a显示多巴胺（DA）和其代谢物二羟基苯基乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的化学结构式。用HPLC-MS分析它们在不同组纹状体中的含量，与对照相比，6-OHDA +盐水组的DA、DOPAC和HVA水平显著降低。而Exos的存在可改善此反应（图8b）。表明Exos增加纹状体中DA及其代谢产物的水平。
图8 Exos上调PD大鼠模型纹状体中DA及其代谢产物的水平
总结：
本研究发现hucMSCs衍生的能逆转6-OHDA对SH-SY5Y细胞存活的抑制作用，保护PD模型鼠的神经元， 且细胞自噬在介导Exos对PD的治疗过程中起到重要作用。
患病率逐年增加的帕金森病（PD）是一种进行性神经变性疾病，研究表明人脐带间充质干细胞（hucMSC）因具神经保护作用，对PD具备治疗效果，但其不可控制的分化及低存活于宿主体内限制了其应用，迫切需要具有类似修复作用的替代hucMSCs移植的替代方法。由河北医科大学第一医院于2020年4月在《Cell Death & Disease》(IF：5.959）上发表了论文“Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson’s disease model by inducing autophagy” ,对hucMSC分泌的Exos是否可以代替hucMSC发挥作用作了探讨。
研究结果：
1. hucMSC细胞分离培养鉴定
利用组织块贴壁方法从人脐带中分离出hucMSC细胞，呈现多边形或纺锤形生长（图1a）。生长的第二天，细胞即可进入对数生长期。第三天，由于更换培养基，生长速度减慢，但第二天又迅速增加，表现出强大的自我更新和繁殖能力（图1b）。FCM分析P3代细胞，其高表达干细胞标志物CD90、CD105和CD73，血细胞标志物CD34、CD45和HLA-DR为阴性表达（图1c）。另细胞能在诱导培养基的作用下分化为软骨细胞、成骨及成脂（图1d）。
因此，该细胞为hucMSC细胞，可用于后续实验。
图1 hucMSC的鉴定
2. 6-羟基多巴胺（6-OHDA）刺激的SH-SY5Y细胞活力
与对照组相比，PD的常用模型药物6-OHDA以剂量依赖性方式抑制SH-SY5Y细胞活力，75 µM的6-OHDA处理细胞18 hours时，细胞活力降低50％（P < 0.001）（图2），因此选择此浓度用于后续实验。图2 6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞活力
3.hucMSCs逆转6-OHDA抑制的SH-SY5Y细胞增殖，且Exos参与该过程
作者建立hucMSC与6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞共培养体系（图3a），分为5组：对照组，6-OHDA组，6-OHDA + GW4869组，6-OHDA + hucMSCs组和6-OHDA + hucMSCs + GW4869组。hucMSCs逆转6-OHDA抑制的SH -SY5Y细胞增殖，同时GW4869可衰减这种作用（图3b）。该阻止细胞直接接触和大囊泡转移的体系表明了Exos可能参与了hucMSC逆转6-OHDA造成的SH-SY5Y细胞活力降低的过程。
图3 Exos功能及鉴定
3.hucMSCs-Exos鉴定及被SH-SY5Y摄取
超速离心提取hucMSCs在无血清培养基中培养48hrs后上清液中的Exos，TEM 、NTA和Western blot对其进行鉴定（图3b）。另借助IF实验证明PKH26-Exos能成功被SH-SY5Y细胞摄取（图3c）。
4.Exos增强SH-SY5Y细胞活力并减少6-OHDA诱导的凋亡
将SH-SY5Y细胞与不同浓度的Exos共培养12 hrs，再用6-OHDA处理，Exos以剂量依赖方式促细胞增殖，在40ug/ml是显著增强（P < 0.05）（图4a）。另Western blot结果显示，与6-OHDA组相比，剪切后的Caspase3在6-OHDA+Exos组中显著降低（图4b），细胞凋亡亦减少（图4c），表明Exos可降低6-OHDA诱导的细胞凋亡作用。
图4 Exos促SH-SY5Y细胞存活抑制凋亡
5. Exos增加6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞自噬水平
为探究Exos是否诱导自噬，作者借助WB分析6-OHDA + Exos组LC3B-II / I和Beclin-1的表达显著增强，而P62的表达下降（图5a）。自噬体与溶酶体融化抑制剂Baf-A1的使用使LC3B-II / I，Beclin-1和p62的水平明显更高，表明Exos激活6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞发生自噬。
GFP-RFP-LC3转染细胞中，用共聚焦显微镜观察自噬体（黄色斑点）和自噬溶酶体（红色斑点）发现，Exos处理增加黄色和红色斑点的数量，Baf-A1在不影响Exos引起的红色斑点数量情况下，进一步增加黄色斑点的数量（图5b），TEM亦证明这一结果（图5c）。
表明由Exos诱导的自噬增加可能为6-OHDA刺激的细胞凋亡提供保护作用。
图5 Exos增加6-OHDA刺激的SH-SY5Y细胞自噬的水平
6.Exos可穿过BBB到达脑黑质（SN），缓解PD模型中的不对称旋转
按图6a处理方式，对PD模型鼠给予盐水和Exos处理后，发现Exos能与SN中多巴胺能神经元（TH：酪氨酸羟化酶）共定位（图6b）。另与6-OHDA +盐水组相比，给Exos处理的鼠随着时间的推移，不对称旋转行为明显减少（图6c）。表明，Exos可以穿越BBB并到达SN，进而改善PD模型鼠的行为缺陷。
图6 Exos在脑组织SN中的积累并改善PD模型的行为缺陷
7.Exos显著减少PD模型的SN多巴胺能神经元损失
对SN进行HE染色分析，6-OHDA +盐水组细胞间隙中出现收缩，表现不同程度的变性和坏死性，IHC分析TH表明，6-OHDA +盐水组的手术侧表现多巴胺能神经元的减少。而Exos在一定程度上的抑制6-OHDA的作用（图7b、c），表现出对SN多巴胺能神经元的保护作用。
图7 Exos减少PD大鼠模型中SN多巴胺能神经元的丢失和凋亡
8.Exos降低PD大鼠模型中TUNEL + / TH +细胞的数量
如图7d所示，与6-OHDA +盐水组相比， 6-OHDA + Exos组中TUNEL + / TH +细胞的数量明显减少。表明Exos可保护多巴胺能神经元免受6-OHDA刺激。
9. Exos上调PD大鼠纹状体中多巴胺及其代谢物的水平
图 8a显示多巴胺（DA）和其代谢物二羟基苯基乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的化学结构式。用HPLC-MS分析它们在不同组纹状体中的含量，与对照相比，6-OHDA +盐水组的DA、DOPAC和HVA水平显著降低。而Exos的存在可改善此反应（图8b）。表明Exos增加纹状体中DA及其代谢产物的水平。
图8 Exos上调PD大鼠模型纹状体中DA及其代谢产物的水平
总结：
本研究发现hucMSCs衍生的能逆转6-OHDA对SH-SY5Y细胞存活的抑制作用，保护PD模型鼠的神经元， 且细胞自噬在介导Exos对PD的治疗过程中起到重要作用。