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公司新闻/正文
脂肪间充质干细胞通过细胞外囊泡转移miR25减少中风小鼠的自噬
696 人阅读发布时间：2021-03-23 13:56
【关键词】脂肪间充质干细胞、自噬、细胞外囊泡/外泌体、中风
【摘要】移植的间充质干细胞（MSCs）分泌细胞外囊泡（EVs）对于中风小鼠模型具有神经保护作用，然而对于EVs内含物及其下游机制的研究很少。体外构建氧糖剥夺的神经元模型，体内构建脑缺血模型，分别验证了脂肪间充质干细胞（ADMSCs）可通过分泌EVs增加自噬通量，调控下游基因来介导神经保护作用，而EVs中的miR25-3p在其中发挥重要作用。
【前言】 MSCs的神经保护作用很早就有报道，但是体内追踪MSCs后发现：移植的干细胞并未整合到神经网络中，也没有取代丢失神经元的特征，因此推测移植细胞通过间接方式发挥作用。目前研究较多的细胞间交互是通过细胞外囊泡（EVs）转移miRNA所介导的，而自噬过程（一种自我降解的过程）可由miRNA调节。
自噬过程包括形成独立的膜结构包裹一些物质进行降解，这一双层膜小泡被称为自噬小体，接着自噬小体会被转移至溶酶体中降解。自噬过程对于神经元的存活来说是一把双刃剑。缺血缺氧诱导的自噬过程一定程度上可促进细胞存活，但是过度的自噬激活可导致神经元的死亡。而MSCs来源的EVs能否调节自噬来发挥神经保护作用尚不清楚，因此本文作者提取EVs后检测自噬在其中的作用，并阐述了内在机制。
文章逻辑验证值得学习借鉴，外泌体提取方法有创新。
【结果】
作者首先利用两种不同的方法（UC和PEG）提取了ADMSC-EVs，利用透射电镜、纳米视线追踪分析鉴定了EVs的形态、大小，通过WB检测了EVs相关指标（阳性指标CD9、CD63、Alix、TSG101，阴性指标albumin、Histone、TOMM20）。因为PEG方法难以区分EVs和非EVs来源的纳米颗粒和蛋白，因此作者采用了一种新的碘克沙醇密度梯度离心方法（OptiPrep）对UC和PEG方法提取的EVs进一步分离并验证相关蛋白标记。
结果显示：UC和PEG可有效分离EVs，而新的密度梯度离心方法可分离不同大小的EV亚型，sEVs（直径在50-200nm）的亚型富集在第七层。
接着验证ADMSC-EVs对氧糖剥夺（OGD）的神经元具有保护作用，并通过WB分析了自噬相关蛋白在其中变化。结果显示：OGD神经元中自噬随时间增加，而UC和PEG两种方法提取的EVs以剂量依赖的方式降低自噬相关蛋白，这种保护作用主要是通过sEVs亚型实现的。
进一步验证EVs的保护作用，以及自噬相关通路。通过RNAase A（水解RNA）和Triton X-100（破坏囊泡的双层膜结构）验证EVs可发挥神经保护作用。利用bafilomycin A1 (BafA1)阻止自噬体-溶酶体形成验证LC3II检测的是自噬通量并非自噬小体在溶酶体降解减少所致，荧光报告检测进一步检测自噬通量变化。分别加入自噬激动剂和抑制剂验证自噬对神经元的作用。WB检测下游自噬相关通路中蛋白变化。结果显示：EVs通过调节自噬变化介导神经保护作用。
通过GW4869抑制神经酰胺合成进而抑制EVs产生，敲除Hrs基因抑制EVs的产生来进一步验证EVs是发挥神经保护作用的关键因素。检测自噬相关通量和下游蛋白，验证EVs可调节自噬来发挥作用。结果显示：干细胞来源的EVs可通过调节自噬发挥神经保护作用。
进一步探究EVs来源的miRNA如何调节自噬的机制。筛选EVs中的miRNA，选择U6和let-7a作为内参进行qRT-PCR验证表达量，在EVs中加入RNaseA和TritonX100分别验证EVs是通过miRNA发挥作用的。在EVs中进行loss of function验证miR25-3p的作用。利用荧光报告素酶系统验证miR25-3p可直接调节自噬相关蛋白。结果显示：EVs来源的miR25-3p调节自噬来发挥神经保护作用。
进行体内实验来验证体外实验的结果。首先观察EVs回输动物模型后的分布情况，对小鼠进行行为学评分，最后处死进行组织学评价神经元密度来评估疗效。结果显示：ADMSCs来源的EVs可分布至损伤部位，减小缺血灶，增加神经元密度来发挥神经保护作用。
验证自噬在神经损伤中的作用，在自噬激动剂和抑制剂存在下检测小鼠行为学评估功能恢复，组织学评估神经元密度，WB检测下游自噬相关蛋白及其下游信号通路相关蛋白的变化；在有/无ADMSC来源的EVs存在下，检测自噬通量相关蛋白以及下游信号通路相关蛋白。结果显示：自噬一定程度上可发挥神经保护作用，而ADMSCs来源的EVs可通过刺激自噬发挥神经保护作用。
体内验证EVs调节自噬是通过miR25-3p发挥作用的。EVs进行miR25-3p的loss of function处理，之后回输动物体内，通过行为学和组织学验证功能恢复与神经保护作用。结果显示：ADMSCs来源的EVs是通过转移miR25-3p，进而上调自噬及其下游信号通路来发挥神经保护作用。
【摘要】移植的间充质干细胞（MSCs）分泌细胞外囊泡（EVs）对于中风小鼠模型具有神经保护作用，然而对于EVs内含物及其下游机制的研究很少。体外构建氧糖剥夺的神经元模型，体内构建脑缺血模型，分别验证了脂肪间充质干细胞（ADMSCs）可通过分泌EVs增加自噬通量，调控下游基因来介导神经保护作用，而EVs中的miR25-3p在其中发挥重要作用。
【前言】 MSCs的神经保护作用很早就有报道，但是体内追踪MSCs后发现：移植的干细胞并未整合到神经网络中，也没有取代丢失神经元的特征，因此推测移植细胞通过间接方式发挥作用。目前研究较多的细胞间交互是通过细胞外囊泡（EVs）转移miRNA所介导的，而自噬过程（一种自我降解的过程）可由miRNA调节。
自噬过程包括形成独立的膜结构包裹一些物质进行降解，这一双层膜小泡被称为自噬小体，接着自噬小体会被转移至溶酶体中降解。自噬过程对于神经元的存活来说是一把双刃剑。缺血缺氧诱导的自噬过程一定程度上可促进细胞存活，但是过度的自噬激活可导致神经元的死亡。而MSCs来源的EVs能否调节自噬来发挥神经保护作用尚不清楚，因此本文作者提取EVs后检测自噬在其中的作用，并阐述了内在机制。
文章逻辑验证值得学习借鉴，外泌体提取方法有创新。
【结果】
作者首先利用两种不同的方法（UC和PEG）提取了ADMSC-EVs，利用透射电镜、纳米视线追踪分析鉴定了EVs的形态、大小，通过WB检测了EVs相关指标（阳性指标CD9、CD63、Alix、TSG101，阴性指标albumin、Histone、TOMM20）。因为PEG方法难以区分EVs和非EVs来源的纳米颗粒和蛋白，因此作者采用了一种新的碘克沙醇密度梯度离心方法（OptiPrep）对UC和PEG方法提取的EVs进一步分离并验证相关蛋白标记。
结果显示：UC和PEG可有效分离EVs，而新的密度梯度离心方法可分离不同大小的EV亚型，sEVs（直径在50-200nm）的亚型富集在第七层。
接着验证ADMSC-EVs对氧糖剥夺（OGD）的神经元具有保护作用，并通过WB分析了自噬相关蛋白在其中变化。结果显示：OGD神经元中自噬随时间增加，而UC和PEG两种方法提取的EVs以剂量依赖的方式降低自噬相关蛋白，这种保护作用主要是通过sEVs亚型实现的。
进一步验证EVs的保护作用，以及自噬相关通路。通过RNAase A（水解RNA）和Triton X-100（破坏囊泡的双层膜结构）验证EVs可发挥神经保护作用。利用bafilomycin A1 (BafA1)阻止自噬体-溶酶体形成验证LC3II检测的是自噬通量并非自噬小体在溶酶体降解减少所致，荧光报告检测进一步检测自噬通量变化。分别加入自噬激动剂和抑制剂验证自噬对神经元的作用。WB检测下游自噬相关通路中蛋白变化。结果显示：EVs通过调节自噬变化介导神经保护作用。
通过GW4869抑制神经酰胺合成进而抑制EVs产生，敲除Hrs基因抑制EVs的产生来进一步验证EVs是发挥神经保护作用的关键因素。检测自噬相关通量和下游蛋白，验证EVs可调节自噬来发挥作用。结果显示：干细胞来源的EVs可通过调节自噬发挥神经保护作用。
进一步探究EVs来源的miRNA如何调节自噬的机制。筛选EVs中的miRNA，选择U6和let-7a作为内参进行qRT-PCR验证表达量，在EVs中加入RNaseA和TritonX100分别验证EVs是通过miRNA发挥作用的。在EVs中进行loss of function验证miR25-3p的作用。利用荧光报告素酶系统验证miR25-3p可直接调节自噬相关蛋白。结果显示：EVs来源的miR25-3p调节自噬来发挥神经保护作用。
进行体内实验来验证体外实验的结果。首先观察EVs回输动物模型后的分布情况，对小鼠进行行为学评分，最后处死进行组织学评价神经元密度来评估疗效。结果显示：ADMSCs来源的EVs可分布至损伤部位，减小缺血灶，增加神经元密度来发挥神经保护作用。
验证自噬在神经损伤中的作用，在自噬激动剂和抑制剂存在下检测小鼠行为学评估功能恢复，组织学评估神经元密度，WB检测下游自噬相关蛋白及其下游信号通路相关蛋白的变化；在有/无ADMSC来源的EVs存在下，检测自噬通量相关蛋白以及下游信号通路相关蛋白。结果显示：自噬一定程度上可发挥神经保护作用，而ADMSCs来源的EVs可通过刺激自噬发挥神经保护作用。
体内验证EVs调节自噬是通过miR25-3p发挥作用的。EVs进行miR25-3p的loss of function处理，之后回输动物体内，通过行为学和组织学验证功能恢复与神经保护作用。结果显示：ADMSCs来源的EVs是通过转移miR25-3p，进而上调自噬及其下游信号通路来发挥神经保护作用。