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公司新闻/正文
MSC来源的小细胞外囊泡通过PD-L1抑制T细胞功能
2235 人阅读发布时间：2021-03-29 10:05
【关键词】间充质干细胞、细胞外囊泡/外泌体、PD-L1、免疫抑制
【摘要】间充质干细胞（MSCs）及其来源的小细胞外囊泡（sEVs/exosomes）具有相似的免疫调节特性。MSC-sEVs表面PD-L1丰度高，将MSC-sEVs输入aGvHD患者，患者循环中PD-L1上调，体外阻断sEVs相关的PDL1的T细胞激活可取消其免疫调节作用，CRISPR-Cas9敲除MSCs的PDL1，其sEVs不能抑制T细胞激活（TCA），而MSCs来源sEVs中PDL1通过T细胞受体发挥作用。因此sEVs相关的PD-L1丰度可预测MSC移植后的效果，同时减少了干细胞直接回输带来的风险。
【前言】 造血干细胞移植可治疗血液系统恶性肿瘤，其依赖的是供体的T细胞可识别并攻击肿瘤组织，然而供体来源的T细胞也可识别并攻击非肿瘤组织造成移植物抗宿主病，调控这一过程的关键因子之一就是PD-L1。PD-L1通过T细胞受体（TCR）调节T细胞的激活（TCA），诱导免疫耐受，PD-L1可通过与供体T细胞表面的CD80相互作用杀死肿瘤，PD-L1也可与PD-1相互作用诱导供体T细胞的免疫耐受防止移植物抗宿主病。
MSCs可用于治疗移植物抗宿主病，而MSCs的免疫调节特性依赖促炎信号的刺激，促炎信号刺激后可上调MSCs的PD-L1。MSCs通常是通过EVs发挥作用的，肿瘤细胞来源的外泌体可通过抑制PD1和PDL1促进自身生长，因而推测MSCs来源的外泌体能否通过调节PDL1来发挥免疫调节功能。
文章思路借鉴自肿瘤细胞的免疫逃逸，非常创新，且体内实验数据来自临床病人，可信度非常高。
【结果】
流式鉴定MSCs，分离EVs进行电镜、纳米追踪观察大小、形态，WB验证EVs的相关marker（CD9、CD63、CD81），验证MSCs的markerCD90。生物层干涉法进一步检测外泌体。流式检测MSCs上PDL1表达，分离不同大小的EVs免疫电镜检测表面PDL1表达。结果表明：MSCs来源的sEVs（外泌体）表明可表达PDL1，且sEVs是PDL1的主要来源。
利用CD3/CD28 Dynabeads刺激PBMCs中的CD4T细胞活化，PepTivator巨细胞病毒（CMV）pp65肽刺激CD8T细胞活化，分别用MSCs来源的sEVs刺激，结果显示：MSC-sEVs可抑制CD4T细胞和CD8T细胞活化，对原始CD4T细胞无影响。
PDL1抗体可减少MSC-sEVs对CD4T细胞的抑制作用，而重新加入充足PDL1后可恢复。充足PDL1对活化的CD4T细胞无作用。结果表明：MSC-sEVs是通过PDL1发挥对CD4T细胞的抑制作用。
蛋白层面验证功能后，基因层面验证。构建PDL1KO的MSCs，用PDL1-/-MSCs处理活化的T细胞，检测T细胞活化程度以及PD1表达，提取PDL1-/-MSCs的sEVs，检测外泌体标志物、形态、产量等，然后处理活化的T细胞，检测T细胞活化程度以及PD1表达。结果表面：PDL1-/-MSCs及其来源的sEVs不能抑制活化的T细胞，表明MSC来源的sEVs上的PDL1是抑制T细胞活化的必要因素。
接着验证MSCs来源的sEVs是否通过PDL1调节TCR下游信号通路。检测活化TCR相关的蛋白pZAP70，荧光报告素酶检测下游的核易位相关因子NFAT。结果表明：MSC-sEVs通过PDL1调节TCR功能及其下游信号通路。
体外验证功能后，进一步在体内验证。aGvDH患者输注MSC-sEVs后，检测PDL1表达，而后利用ExoView芯片分析患者血浆中sEVs的数量和种群亚型。结果表明：MSC-sEVs中PDL1与MSC的免疫抑制特性相关。
用临床相关预后指标ST2、REG3A评估回输MSC-sEVs后的疗效。
分析MSC-sEVs的PDL1上调的影响因素。体外用IFN-γ处理后检测PDL1表达量。比较患者血浆分离EVs前后PDL1的表达量差异进而分析体内PDL1水平上调是否来源于MSC-sEVs。结果表明：MSC-sEVs可上调患者体内 PDL1，且sEVs是PDL1的主要来源。
循环sEVs中PDL1在一段时间后下调，验证是否是被外周血细胞所摄取。裸鼠体内验证，回输至裸鼠后分析血细胞进行流式检测，最终结果表明：外周血细胞可摄取MSC-sEVs。
【摘要】间充质干细胞（MSCs）及其来源的小细胞外囊泡（sEVs/exosomes）具有相似的免疫调节特性。MSC-sEVs表面PD-L1丰度高，将MSC-sEVs输入aGvHD患者，患者循环中PD-L1上调，体外阻断sEVs相关的PDL1的T细胞激活可取消其免疫调节作用，CRISPR-Cas9敲除MSCs的PDL1，其sEVs不能抑制T细胞激活（TCA），而MSCs来源sEVs中PDL1通过T细胞受体发挥作用。因此sEVs相关的PD-L1丰度可预测MSC移植后的效果，同时减少了干细胞直接回输带来的风险。
【前言】 造血干细胞移植可治疗血液系统恶性肿瘤，其依赖的是供体的T细胞可识别并攻击肿瘤组织，然而供体来源的T细胞也可识别并攻击非肿瘤组织造成移植物抗宿主病，调控这一过程的关键因子之一就是PD-L1。PD-L1通过T细胞受体（TCR）调节T细胞的激活（TCA），诱导免疫耐受，PD-L1可通过与供体T细胞表面的CD80相互作用杀死肿瘤，PD-L1也可与PD-1相互作用诱导供体T细胞的免疫耐受防止移植物抗宿主病。
MSCs可用于治疗移植物抗宿主病，而MSCs的免疫调节特性依赖促炎信号的刺激，促炎信号刺激后可上调MSCs的PD-L1。MSCs通常是通过EVs发挥作用的，肿瘤细胞来源的外泌体可通过抑制PD1和PDL1促进自身生长，因而推测MSCs来源的外泌体能否通过调节PDL1来发挥免疫调节功能。
文章思路借鉴自肿瘤细胞的免疫逃逸，非常创新，且体内实验数据来自临床病人，可信度非常高。
【结果】
流式鉴定MSCs，分离EVs进行电镜、纳米追踪观察大小、形态，WB验证EVs的相关marker（CD9、CD63、CD81），验证MSCs的markerCD90。生物层干涉法进一步检测外泌体。流式检测MSCs上PDL1表达，分离不同大小的EVs免疫电镜检测表面PDL1表达。结果表明：MSCs来源的sEVs（外泌体）表明可表达PDL1，且sEVs是PDL1的主要来源。
利用CD3/CD28 Dynabeads刺激PBMCs中的CD4T细胞活化，PepTivator巨细胞病毒（CMV）pp65肽刺激CD8T细胞活化，分别用MSCs来源的sEVs刺激，结果显示：MSC-sEVs可抑制CD4T细胞和CD8T细胞活化，对原始CD4T细胞无影响。
PDL1抗体可减少MSC-sEVs对CD4T细胞的抑制作用，而重新加入充足PDL1后可恢复。充足PDL1对活化的CD4T细胞无作用。结果表明：MSC-sEVs是通过PDL1发挥对CD4T细胞的抑制作用。
蛋白层面验证功能后，基因层面验证。构建PDL1KO的MSCs，用PDL1-/-MSCs处理活化的T细胞，检测T细胞活化程度以及PD1表达，提取PDL1-/-MSCs的sEVs，检测外泌体标志物、形态、产量等，然后处理活化的T细胞，检测T细胞活化程度以及PD1表达。结果表面：PDL1-/-MSCs及其来源的sEVs不能抑制活化的T细胞，表明MSC来源的sEVs上的PDL1是抑制T细胞活化的必要因素。
接着验证MSCs来源的sEVs是否通过PDL1调节TCR下游信号通路。检测活化TCR相关的蛋白pZAP70，荧光报告素酶检测下游的核易位相关因子NFAT。结果表明：MSC-sEVs通过PDL1调节TCR功能及其下游信号通路。
体外验证功能后，进一步在体内验证。aGvDH患者输注MSC-sEVs后，检测PDL1表达，而后利用ExoView芯片分析患者血浆中sEVs的数量和种群亚型。结果表明：MSC-sEVs中PDL1与MSC的免疫抑制特性相关。
用临床相关预后指标ST2、REG3A评估回输MSC-sEVs后的疗效。
分析MSC-sEVs的PDL1上调的影响因素。体外用IFN-γ处理后检测PDL1表达量。比较患者血浆分离EVs前后PDL1的表达量差异进而分析体内PDL1水平上调是否来源于MSC-sEVs。结果表明：MSC-sEVs可上调患者体内 PDL1，且sEVs是PDL1的主要来源。
循环sEVs中PDL1在一段时间后下调，验证是否是被外周血细胞所摄取。裸鼠体内验证，回输至裸鼠后分析血细胞进行流式检测，最终结果表明：外周血细胞可摄取MSC-sEVs。