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研载生物科技（上海）有限公司
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公司新闻/正文
人血管类器官穿透人脑类器官形成血管样系统
740 人阅读发布时间：2022-05-16 11:22
二维培养不适合维持人体组织的结构和功能，因此近几年来类器官被开发并应用于药物发现和再生医学的研究，但随着类器官体积的增加，缺氧及代谢废物会导致组织坏死，因此类器官血管化在类器官研究过程中至关重要，此次为大家带来一篇关于人脑类器官血管化的研究。
以期的研究用培养的内皮细胞EC在皮质类器官中建立血管结构，但培养的EC缺乏小管发生和组织特异性，使其不太可能发育成血管，此外仅EC不能建立完整的血管结构。然而研究表明人类干细胞来源的人类血管类器官hBVO可以重建人类血管的结构和功能，但未研究其与其他细胞类型之间的相互作用，在此文章中，作者将hBVO解离成小团块，与皮质类器官共培养，以模拟胚胎神经血管的发育，结果显示hBVO在神经细胞系中具有血管化能力。
技术路线：
1. hBVOs的制备
用CHIR99021 和BMP4将hiPSC诱导成中胚层后，用VEGF-A和forakolin诱导其分化成血管细胞，在第5天，将其被嵌入到含有VEGF-A和bFGF的Collagen I/Matrigel 溶液中。血管发生后，将hBVO分离成单个类器官。Confocal显示hBVO 中有网状CD31+ 内皮网络包裹在SMA+ SMC 或 PDGFRβ+ PC中，同时有collagen IV+ 基底膜。表明，2周内hiPSCs可分化成hBVOs，且由典型的血管细胞类型和细胞外基质组成。
在人大脑的血管中，PC与EC的比率是1:1，以维持BBB的完整性。但hBVO由12.3±1.8% 的EC和69.2±0.38% 的PC组成，PC大约是EC的5倍。为了增加 EC 的比例，作者通过将StemPro34培养基换为 EGM-2，但细胞比例没有改变。
2. 脑类器官的血管化
为验证hBVO是否可以使脑类器官血管化。作者首先用accutase解离人脑类器官hCOs和hBVOs，用血细胞计数器计数后，将第15天的hBVO被解离成团块，以1:10的比例添加到第5天的hCOs中，在培养基中维持一段时间，再嵌入到培养基稀释的基质胶中。培养到第13天后，将类器官转移到摇床上培养。第13天的类器官表面即可检测到CD31+ 血管样细胞。说明hBVOs和hCOs的共培养形成了 vhCOs。
接者，作者优化了培养基中FBS 浓度。发现与其他浓度相比，5% FBS培养基中的 vhCOs 显示出更多的血管样网络。在0%和5% FBS条件下，80%的vhCOs在第50天成功形成CD31+ 内皮样网络。表明5% FBS对hCOs的血管化是最佳的。通过葡聚糖灌注实验，发现vhCOs中的管状结构清晰可见，而hCOs没有荧光信号，证明了在vhCOs中存在可灌注的血管网络。但这并不意味着vhCOs中的血管样结构具有血脑屏障BBB样通透性。
3. vhCO的鉴定
为了确定vhCO中的血管样管是否表现出血管的典型结构，在第30天对其进行了免疫荧光染色，发现内皮样管富含SMA + SMC样细胞，在其外围检测到PDGFRβ+ PC和collagen IV+ 基底膜。CD144+和KDR+内皮祖细胞样细胞也存在于vhCOs的血管样结构中。结合Confocal呈现的TUJ1+神经元细胞和CD31+ECs，表明vhCO一个由神经细胞和血管样结构组成的复杂系统。说明，hBVO在vhCOs中形成了典型的血管样结构，并可与神经样网络共存50天。
为确定EC是源自hBVO，作者将表达EGFP的iPSC诱导分化为hBVO，与hCOs培养3天后，EGFP+细胞存在于vhCOs的表面，但不存在于 hCOs 的表面。鉴于CD31+ECs均表达EGFP，而部分EGFP+细胞表达 CD31，该结果表明 vhCOs 中的血管网络来源于 hBVOs。
第30天ZO-1+紧密连接蛋白位于vhCO中的ECs之间。同时RT-qPCR显示，与hCO相比，紧密连接相关基因（Occludin、葡萄糖转运蛋白1、ABCB1和ZO-1）的表达水平在 vhCO 中显着上调。而GFAP+星形胶质细胞样细胞没有像体内神经血管系统一样覆盖 vhCOs 中的 CD31+内皮管。尽管vhCOs表达了与 BBB相关的紧密连接蛋白，但它并没有显示出类似内的形态学表型。
讨论：
作者的研究表明，hBVO可以渗入hCO形成血管化人脑类器官，vhCOs可以作为研究人类皮质发育和神经血管疾病的模型，亦可作为药物筛选和脑血管药效学的替代物。
【欢迎来电/邮件咨询】
电话：021-54376058
手机：18516646410/13917998048（微信同号）
邮箱：yanzaibio@yihaowan.cn, yanzaibio@163.com
地址： 上海市闵行区放鹤路1088号博济科技园6号楼109室
以期的研究用培养的内皮细胞EC在皮质类器官中建立血管结构，但培养的EC缺乏小管发生和组织特异性，使其不太可能发育成血管，此外仅EC不能建立完整的血管结构。然而研究表明人类干细胞来源的人类血管类器官hBVO可以重建人类血管的结构和功能，但未研究其与其他细胞类型之间的相互作用，在此文章中，作者将hBVO解离成小团块，与皮质类器官共培养，以模拟胚胎神经血管的发育，结果显示hBVO在神经细胞系中具有血管化能力。
技术路线：
1. hBVOs的制备
用CHIR99021 和BMP4将hiPSC诱导成中胚层后，用VEGF-A和forakolin诱导其分化成血管细胞，在第5天，将其被嵌入到含有VEGF-A和bFGF的Collagen I/Matrigel 溶液中。血管发生后，将hBVO分离成单个类器官。Confocal显示hBVO 中有网状CD31+ 内皮网络包裹在SMA+ SMC 或 PDGFRβ+ PC中，同时有collagen IV+ 基底膜。表明，2周内hiPSCs可分化成hBVOs，且由典型的血管细胞类型和细胞外基质组成。
在人大脑的血管中，PC与EC的比率是1:1，以维持BBB的完整性。但hBVO由12.3±1.8% 的EC和69.2±0.38% 的PC组成，PC大约是EC的5倍。为了增加 EC 的比例，作者通过将StemPro34培养基换为 EGM-2，但细胞比例没有改变。
2. 脑类器官的血管化
为验证hBVO是否可以使脑类器官血管化。作者首先用accutase解离人脑类器官hCOs和hBVOs，用血细胞计数器计数后，将第15天的hBVO被解离成团块，以1:10的比例添加到第5天的hCOs中，在培养基中维持一段时间，再嵌入到培养基稀释的基质胶中。培养到第13天后，将类器官转移到摇床上培养。第13天的类器官表面即可检测到CD31+ 血管样细胞。说明hBVOs和hCOs的共培养形成了 vhCOs。
接者，作者优化了培养基中FBS 浓度。发现与其他浓度相比，5% FBS培养基中的 vhCOs 显示出更多的血管样网络。在0%和5% FBS条件下，80%的vhCOs在第50天成功形成CD31+ 内皮样网络。表明5% FBS对hCOs的血管化是最佳的。通过葡聚糖灌注实验，发现vhCOs中的管状结构清晰可见，而hCOs没有荧光信号，证明了在vhCOs中存在可灌注的血管网络。但这并不意味着vhCOs中的血管样结构具有血脑屏障BBB样通透性。
3. vhCO的鉴定
为了确定vhCO中的血管样管是否表现出血管的典型结构，在第30天对其进行了免疫荧光染色，发现内皮样管富含SMA + SMC样细胞，在其外围检测到PDGFRβ+ PC和collagen IV+ 基底膜。CD144+和KDR+内皮祖细胞样细胞也存在于vhCOs的血管样结构中。结合Confocal呈现的TUJ1+神经元细胞和CD31+ECs，表明vhCO一个由神经细胞和血管样结构组成的复杂系统。说明，hBVO在vhCOs中形成了典型的血管样结构，并可与神经样网络共存50天。
为确定EC是源自hBVO，作者将表达EGFP的iPSC诱导分化为hBVO，与hCOs培养3天后，EGFP+细胞存在于vhCOs的表面，但不存在于 hCOs 的表面。鉴于CD31+ECs均表达EGFP，而部分EGFP+细胞表达 CD31，该结果表明 vhCOs 中的血管网络来源于 hBVOs。
第30天ZO-1+紧密连接蛋白位于vhCO中的ECs之间。同时RT-qPCR显示，与hCO相比，紧密连接相关基因（Occludin、葡萄糖转运蛋白1、ABCB1和ZO-1）的表达水平在 vhCO 中显着上调。而GFAP+星形胶质细胞样细胞没有像体内神经血管系统一样覆盖 vhCOs 中的 CD31+内皮管。尽管vhCOs表达了与 BBB相关的紧密连接蛋白，但它并没有显示出类似内的形态学表型。
讨论：
作者的研究表明，hBVO可以渗入hCO形成血管化人脑类器官，vhCOs可以作为研究人类皮质发育和神经血管疾病的模型，亦可作为药物筛选和脑血管药效学的替代物。
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