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公司新闻/正文
11分+！解锁tsRNA在结直肠癌中发挥的重要作用
2403 人阅读发布时间：2022-06-30 16:45
大量研究集中于miRNA、lncRNA、piRNA和circRNA，很少人关注tRNA，最近的研究确定tRNA可以在压力条件下被切割，形成tsRNA，参与到各种细胞过程，并在癌症进展中发挥重要作用，然而，tsRNA参与结直肠癌CRC进展过程仍然不清楚，今天为大家分享一篇发表在J Exp Clin Cancer Res上的文章，对此进行了探究。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7885485/
tsRNA根据酶切位点和长度的不同可分为half-tRNA（即tiRNA，30-45nt）和tRF（14-30nt）。tiRNA是由angiogenin（ANG）在多种应激条件下，在成熟tRNA的反密码子环处特异性切割产生的5'-和3'-tiRNA。尽管研究者对tsRNA产生了兴趣，但tsRNA的生物发生和机制仍然在很大程度上是未知的，在本研究中，作者发现5'tiRNA-His-GTG在CRC进展中发挥促癌作用，缺氧环境中，在HIFα/ANG轴的调节下，5'tiRNA-His-GTG与大肿瘤抑制激酶2（LATS2）相互作用以抑制hippo信号通路，最终促进促增殖和抗凋亡相关基因的表达。
结果:
1. 5'tiRNA-His-GTG在人CRC组织中上调并与肿瘤大小相关
对CRC和正常组织进行二代测序，以变化倍数≥2或<0.5且p值<0.05为筛选标准，结合q-PCR验证，筛选出5'tiRNA-His-GTG、3'tiRNA-Ile-AAT、3'tiRNA-Lys-CTT和3'tiRNA-Arg-TCT-2-1在CRC组织中上调。鉴于5'tiRNA-His-GTG上调最高，且5'tiRNA比3'tiRNA具有更高的生物学意义，因此作者就5'tiRNA-His-GTG进行了进一步研究。此外通过临床数据分析发现5'tiRNA-His-GTG与肿瘤大小呈正相关，与年龄、性别或临床分期无关。
2. 5'tiRNA-His-GTG的特征及检测方法
5'tiRNA-His-GTG来源于成熟的tRNA-His-GTG，长度为35nt，q-PCR分析显示5'tiRNA-His-GTG主要位于细胞质中。由于tRNA上存在大量的转录后修饰，而这些修饰在tRNA被切割成tsRNA时仍被保留下来，所以目前检测tsRNA的方法需要对RNA预处理，去掉的修饰，并进行3'/5'端加接头序列，而5'tiRNA-His-GTG只需要3'端接头连接，因此作者提出了一种简化的cDNA合成方法Stem-loop RT PCR，该方法不需要RNA预处理，并通过Sanger和Northern印记验证了该方法的可行性及准确性。
3. 5'tiRNA-His-GTG在CRC中发挥致癌作用
在CRC细胞中高表达或敲低5'tiRNA-His-GTG后，发现5'tiRNA-His-GTG mimic能促进细胞增殖，而5'tiRNA-His-GTG inhibitor抑制细胞增殖，减少集落形成，诱导细胞凋亡。此外，CRC肿瘤模型瘤体中给予5'tiRNA-His-GTG agomir和antagomir处理后，两者的结果呈现相反趋势，但与体外结果一致，5'tiRNA-His-GTG agomir能促进肿瘤生长，抑制细胞凋亡，表明5'tiRNA-His-GTG在CRC进展中发挥致癌作用。
4. 5'tiRNA-His-GTG由缺氧/HIFα/ANG轴调控
瘤组织的快速生长会导致营养和氧气供应不足，从而形成缺氧环境，而缺氧能诱导tiRNA的产生，这也解释了5'tiRNA-His-GTG与肿瘤大小有关的原因。在体外，将细胞进行缺氧培养，可促进5'tiRNA-His-GTG、HIFα和ANG的表达。缺氧培养的细胞中敲低ANG后， 5'tiRNA-His-GTG的表达水平会下降，此外HIFα的抑制剂能抑制缺氧诱导的5'tiRNA-His-GTG和ANG的表达，表明HIFα是缺氧诱导的5'tiRNA-His-GTG的关键上游调节因子。另外通过生信预测和荧光素酶检测发现HIFα能靶向结合ANG启动子。表明5'tiRNA-His-GTG是由缺氧/HIFα/ANG轴调控的。
5. 5'tiRNA-His-GTG靶向LATS2并抑制hippo信号通路
借助TargetSan和miRanda预测工具及q-PCR分析，发现过表达5'tiRNA-His-GTG后hippo信号通路中的LATS2表达下降，且在体内外5'tiRNA-His-GTG的上调均能下调LATS2和磷酸化YAP，上调总YAP水平，且能影响hippo信号通路相关基因的表达。通过生信预测结合荧光素酶检测发现在AGO1和AGO3的参与下，5'tiRNA-His-GTG能靶向LATS2的3'UTR区域，抑制剂LATS2表达。
6. 敲低LATS2部分挽救5'tiRNA-His-GTG inhibitor对CRC细胞的抑制作用
为研究5'tiRNA-His-GTG的促癌作用是否依赖LATS2，作者在细胞内同时敲低5'tiRNA-His-GTG和LATS2，发现敲低LATS2后能削弱5'tiRNA-His-GTG inhibitor对细胞增殖和集落形成的抑制作用，降低了YAP的磷酸化水平，但增加了其总水平，且上调了hippo信号通路的一些下游基因。结果表明LATS2参与了5'tiRNA-His-GTG的促癌作用，但不完全依赖于LATS2。
讨论:
本研究发现癌细胞的持续快速生长所造就的缺氧环境，刺激了HIFα的表达，促进ANG转录，进而增加5'tiRNA-His-GTG的水平，5'tiRNA-His-GTG即可通过抑制LATS2翻译关闭hippo信号通路，说明CRC细胞可能通过产生5'tiRNA-His-GTG来保护自己免受缺氧环境的影响。该研究成果提供了一种新的CRC进展机制，为治疗CRC提供新的策略。
文章链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7885485/
技术路线：
结果:
1. 5'tiRNA-His-GTG在人CRC组织中上调并与肿瘤大小相关
对CRC和正常组织进行二代测序，以变化倍数≥2或<0.5且p值<0.05为筛选标准，结合q-PCR验证，筛选出5'tiRNA-His-GTG、3'tiRNA-Ile-AAT、3'tiRNA-Lys-CTT和3'tiRNA-Arg-TCT-2-1在CRC组织中上调。鉴于5'tiRNA-His-GTG上调最高，且5'tiRNA比3'tiRNA具有更高的生物学意义，因此作者就5'tiRNA-His-GTG进行了进一步研究。此外通过临床数据分析发现5'tiRNA-His-GTG与肿瘤大小呈正相关，与年龄、性别或临床分期无关。
2. 5'tiRNA-His-GTG的特征及检测方法
5'tiRNA-His-GTG来源于成熟的tRNA-His-GTG，长度为35nt，q-PCR分析显示5'tiRNA-His-GTG主要位于细胞质中。由于tRNA上存在大量的转录后修饰，而这些修饰在tRNA被切割成tsRNA时仍被保留下来，所以目前检测tsRNA的方法需要对RNA预处理，去掉的修饰，并进行3'/5'端加接头序列，而5'tiRNA-His-GTG只需要3'端接头连接，因此作者提出了一种简化的cDNA合成方法Stem-loop RT PCR，该方法不需要RNA预处理，并通过Sanger和Northern印记验证了该方法的可行性及准确性。
3. 5'tiRNA-His-GTG在CRC中发挥致癌作用
在CRC细胞中高表达或敲低5'tiRNA-His-GTG后，发现5'tiRNA-His-GTG mimic能促进细胞增殖，而5'tiRNA-His-GTG inhibitor抑制细胞增殖，减少集落形成，诱导细胞凋亡。此外，CRC肿瘤模型瘤体中给予5'tiRNA-His-GTG agomir和antagomir处理后，两者的结果呈现相反趋势，但与体外结果一致，5'tiRNA-His-GTG agomir能促进肿瘤生长，抑制细胞凋亡，表明5'tiRNA-His-GTG在CRC进展中发挥致癌作用。
瘤组织的快速生长会导致营养和氧气供应不足，从而形成缺氧环境，而缺氧能诱导tiRNA的产生，这也解释了5'tiRNA-His-GTG与肿瘤大小有关的原因。在体外，将细胞进行缺氧培养，可促进5'tiRNA-His-GTG、HIFα和ANG的表达。缺氧培养的细胞中敲低ANG后， 5'tiRNA-His-GTG的表达水平会下降，此外HIFα的抑制剂能抑制缺氧诱导的5'tiRNA-His-GTG和ANG的表达，表明HIFα是缺氧诱导的5'tiRNA-His-GTG的关键上游调节因子。另外通过生信预测和荧光素酶检测发现HIFα能靶向结合ANG启动子。表明5'tiRNA-His-GTG是由缺氧/HIFα/ANG轴调控的。
借助TargetSan和miRanda预测工具及q-PCR分析，发现过表达5'tiRNA-His-GTG后hippo信号通路中的LATS2表达下降，且在体内外5'tiRNA-His-GTG的上调均能下调LATS2和磷酸化YAP，上调总YAP水平，且能影响hippo信号通路相关基因的表达。通过生信预测结合荧光素酶检测发现在AGO1和AGO3的参与下，5'tiRNA-His-GTG能靶向LATS2的3'UTR区域，抑制剂LATS2表达。
为研究5'tiRNA-His-GTG的促癌作用是否依赖LATS2，作者在细胞内同时敲低5'tiRNA-His-GTG和LATS2，发现敲低LATS2后能削弱5'tiRNA-His-GTG inhibitor对细胞增殖和集落形成的抑制作用，降低了YAP的磷酸化水平，但增加了其总水平，且上调了hippo信号通路的一些下游基因。结果表明LATS2参与了5'tiRNA-His-GTG的促癌作用，但不完全依赖于LATS2。
讨论:
本研究发现癌细胞的持续快速生长所造就的缺氧环境，刺激了HIFα的表达，促进ANG转录，进而增加5'tiRNA-His-GTG的水平，5'tiRNA-His-GTG即可通过抑制LATS2翻译关闭hippo信号通路，说明CRC细胞可能通过产生5'tiRNA-His-GTG来保护自己免受缺氧环境的影响。该研究成果提供了一种新的CRC进展机制，为治疗CRC提供新的策略。