【Theranostics】11分+，脂肪MSC外泌体治疗急性肺损伤的机制研究

       急性肺损伤(ALI)是由多种致病因素引起的临床综合征，巨噬细胞异常激活和线粒体解离与其发病机制相关，LPS等感染因子已被证实可诱发ALI。MSC-EV因具有低免疫原性、无致瘤性、安全性高和伦理问题少的优势，使其成为治疗炎症性疾病的一种无细胞疗法，但在治疗ALI中的作用及其机制尚待明确。
       南京中医药大学的史丽云课题组探究了AdMSC-EV的线粒体捐献是否改善巨噬细胞线粒体功能，保护内毒素诱导的小鼠ALI。将研究成果发表在Theranostics(IF:11.600)杂志上。 实验结果：
1. AdMSC-EV的分离、纯化和表征
       对从人脂肪组织中分离得到的AdMSC细胞进行鉴定，传代培养3-8代后，通过梯度离心从其培养上清液中分离EV。经鉴定，获得的EV具有典型的双凹形态，粒径范围为50-150nm，CD9、CD63和TSG101呈阳性。
 
2. AdMSC-EV将线粒体成分转移到巨噬细胞
       从线粒体探针Mito Tracker Red标记的AdMSC细胞中分离EV，再与鼠肺泡巨噬细胞MH-S共孵育，在MH-S细胞线粒体中可见Mito-Red。为排除是残留染料导致的，先用EtBr耗尽MH-S细胞中mDNA，再与AdMSC-EV共孵育，仍可检测到mDNA的存在。用氯丙嗪或木黄酮抑制内吞作用后，则抑制了AdMSC-EV的内化。表明AdMSC-EV携带mDNA通过内吞作用被靶细胞摄取。
       根据AdMSC-EV的蛋白质浓度与颗粒数，按1x10⁷个EV的蛋白质浓度为10ug/ml，将MH-S:EV以1:10、1:25、1:50和1:100的比例进行共孵育，FACS分析发现MH-S细胞中Mito-Red阳性率随EV量的增加而增加。表明AdMSC-EV可将线粒体成分转移到肺泡巨噬细胞中，且与细胞内线粒体共定位。
3. 人线粒体DNA(mDNA)通过AdMSC-EV转移并改善巨噬细胞线粒体适应性
      为确认哪些线粒体成分被AdMSC-EV转移，首先检测了MH-S细胞的mDNA，发现在AdMSC-EV处理后，mDNA水平增加。同时，通过琼脂糖电泳在AdMSC-EV中检测到mDNA(16.5kb)；若用EtBr去除AdMSC中的mDNA，则在AdMSC-EV中检测不到mDNA。使用人类特异性mDNA引物，可在AdMSC-EV中检测到线粒体基因ND1和ND5的表达，MH-S与AdMSC-EV共孵育后ND1和ND5基因表达增加。
       mDNA作为一种损伤相关分子模式，能识别巨噬细胞中的AIM或cGAS受体，但与AdMSC-EV-mDNA相比，游离的mDNA不影响LPS诱导的细胞炎症反应。由于mDNA通常与相关蛋白质共存，通过WB检测，发现线粒体内TOM20和NDUFV2蛋白质存在于AdMSC-EV中，可能参与维持mDNA结构。表明AdMSC-EV通过转移mDNA恢复了受体巨噬细胞中mDNA的水平。
4. AdMSC-EV转移的线粒体成分可改善巨噬细胞线粒体功能
       为了解AdMSC是否通过提供mDNA缓解巨噬细胞中的线粒体应激，用LPS刺激MH-S细胞，诱导线粒体数量减少、嵴杂乱无章、腔内出现空泡等；但在AdMSC-EV的预处理下则能抑制LPS诱导的线粒体损伤和细胞凋亡，细胞内mDNA和ATP的量亦有所增加，表明AdMSC-EV通过传递mDNA，增加了受损巨噬细胞的mDNA水平和产能能力。
       通过Seahorse XF分析仪分析发现AdMSC-EV的预处理能抑制LPS诱导的线粒体耗氧率降低，此外AdMSC-EV减轻了ROS应激，细胞中代表呼吸链复合物I、II、III、IV和V的线粒体基因网络表达增加，恢复了泛醌氧化还原酶核心亚基V2(NDUFV2)的表达，从而缓解LPS刺激的线粒体病理学。若敲低MH-S细胞中的NDUFV2，AdMSC-EV亦能有效增加细胞中NDUFV2的表达。在AdMSC细胞中敲低NDUFV2后，则EV 抑制LPS诱导的炎性细胞因子表达的能力减弱，且不能恢复线粒体功能。以上数据进一步证明了AdMSC-EV携带的线粒体成分对其功能至关重要。
5. AdMSC-EV转移的线粒体成分促进内毒素刺激的巨噬细胞向抗炎表型转变
       AdMSC-EV抑制了LPS诱导的促炎因子(IL-6、TNF-a和IL-1B)和M1标志基因iNOS的表达；同时，巨噬细胞中M2标志基因IL-10和Arg-1的表达在AdMSC-EV处理后显著增加。FASC分析显示，在LPS刺激的MH-S细胞中，AdMSC-EV能下调MHCII的水平，增加CD206的表达。表明AdMSC-EV诱使LPS刺激的巨噬细胞从M1型转变为M2型。
       LPS刺激巨噬细胞线粒体氧化应激后产生的ROS可促进NF-kB和MAPKs信号通路活化，而AdMSC-EV的处理阻止了p65/NF-kB及其上游信号分子的激活，JNK、ERK和p38激酶磷酸化亦被抑制。DNase I的预处理大大消除了AdMSC-EV的抗炎作用，蛋白酶处理的AdMSC-EV仍具抗炎作用。表明AdMSC-EV抑制了调节促炎因子表达的关键信号通路，诱导LPS刺激的巨噬细胞促炎表型逆转。
6. AdMSC-EV可减轻小鼠的肺部炎症和损伤
      尾静脉给予AdMSC-EV治疗，可减轻LPS诱导的小鼠肺损伤，降低炎性细胞浸润，诱导肺泡壁变薄。在体内，AdMSC-EV可被ACE-I和ACE-II细胞内化，诱导肺泡灌洗液(BALF)中的细胞量、蛋白质及MPO的活性降低，M1型细胞因子的产生减少，IL-10表达增加。FACS显示，AdMSC-EV的使用增加了肺泡巨噬细胞的含量，促炎性中性粒细胞和单核细胞来源的巨噬细胞数量降低，提高致死剂量内毒素下小鼠的存活率。若将无mDNA的AdMSC-EV处理ALI小鼠，则降低了AdMSC-EV在肺炎中的抗炎和组织保护作用。
7. AdMSC-EV治疗可改善体内巨噬细胞的线粒体功能
      与体外结果一致，在体内AdMSC-EV可被肺巨噬细胞摄取，增加mDNA和ATP水平，减少功能失调的线粒体和ROS释放，改善了内毒素破坏的线粒体完整性和功能。与线粒体合成及稳态相关的基因(PGC-1a、TFAM和Sirt1)，和与呼吸链相关的基因(COX15、NDUFV2、ATP5d和ATP5h)，在AdMSC-EV治疗后表达水平显著增加。表明AdMSC-EV改善了LPS刺激的小鼠肺巨噬细胞的线粒体功能和免疫稳态。
8. AdMSC-EV对ALI的治疗作用在很大程度上取决于肺泡巨噬细胞
       接着研究肺巨噬细胞在AdMSC-EV治疗ALI中的作用。小鼠气管内滴注氯膦suan盐脂质体(CL2MBP)以清除肺中的巨噬细胞，但此时AdMSC-EV的抗炎和组织保护作用在很大程度上被减弱，且不能抑制LPS诱导中性粒细胞和单核巨噬细胞的肺浸润。清除肺巨噬细胞后，BALF中中性粒细胞的百分比未增加，这与IL-6的水平有关，可能有其他细胞参与诱导中性粒细胞和IL-6的表达，此外肺巨噬细胞的清除会破坏肺炎中凋亡中性粒细胞的清除，从而影响中性粒细胞的存在及IL-6的表达。表明肺巨噬细胞是负责AdMSC-EV对抗ALI的主要效应物。  
讨论：
      本研究表明人AdMSC来源的EV通过转移mDNA，改善肺巨噬细胞中线粒体的完整性和氧化磷酸化水平，促进肺巨噬细胞代谢和免疫稳态，进而减轻ALI的严重程度。由于对治疗COVID-19等严重肺部疾病有迫切需要，因此使用EV制剂治疗急性肺损伤具有重要意义。