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公司新闻/正文
又一篇外泌体&铁死亡研究思路文章，一区9分＋，建议收藏！
2826 人阅读发布时间：2022-09-07 11:55
肝星形细胞(HSC)的活化增加是导致肝纤维化的主要因素，靶向诱导HSC灭活有助于建立有效的抗纤维化治疗方法。人脐带间充质干细胞(huMSC)及其EV可通过抑制HSC活化来缓解纤维化，然而其治疗机制尚不清楚。
铁死亡是由过度的脂质过氧化引起的调节性细胞死亡，在肝纤维化的发生发展中起着重要作用，BECN1是铁死亡的关键调节因子，但MSC-EV是否通过转运BECN1诱导HSC铁死亡尚未研究。江苏大学严永敏课题组探究了MSC-EV在HSC铁死亡中的作用及其作用机制，该研究于2022年4月发表在Cell Death & Disease(IF:9.685)上。 技术路线：
实验结果：
1. MSC-EV在体外诱导HSC铁死亡
基于铁死亡与慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的发生发展密切相关，因此假设MSC-EV能通过调节HSC的铁死亡来改善纤维化。从MSC培养上清液分离EV后进行表征，再与LX-2细胞共孵育，FDA显示MSC-EV可诱导LX-2细胞死亡。分析铁死亡相关标志物发现，MSC-EV的作用下，细胞内ROS水平增加、线粒体膜电位降低、GSH降低、MDA和Fe2+增加，但铁死亡抑制剂NAC的存在可抑制MSC-EV的促铁死亡作用。同时通过TEM结果可以看出，在MSC-EV的作用下，LX-2细胞内线粒体皱缩，膜密度增加。
为探究MSC-EV对LX-2细胞死亡的特异性，用MSC-EV分别处理人肝正常细胞L-02和人胎肺成纤维细胞HFL-1。FDA和ROS测定发现，MSC-EV降低L-02细胞死亡和ROS产生，不影响铁死亡标记物GPX4的表达；MSC-EV对HFL-1细胞死亡和ROS产生无影响。表明MSC-EV在体外可诱导HSC铁死亡。
2. MSC-EV携带的BECN1下调LX-2中System xC-/GPX4的表达
BECN1通过结合xCT阻断xc-活性来诱导铁死亡，接着研究BECN1是否参与MSC-EV的促铁死亡过程。利用WB检测发现BECN1在MSC-EV中富集，QPCR、IF和WB结果显示MSC-EV对BECN1的mRNA表达无影响，但会下调xCT和HSC活化标志物a-SMA的水平，上调BECN1的蛋白质水平。表明MSC-EV可能通过介导BECN1蛋白转移而不是BECN1 mRNA诱导HSC铁死亡。
3. MSC-EV在小鼠纤维化肝脏中诱导BECN1介导的铁死亡
为在体内探究MSC-EV诱导活化的HSC发生铁死亡，作者通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型，再给予MSC-EV治疗，发现与对照组相比，MSC-EV处理的纤维化肝脏中xCT、GPX4和a-SMA的表达受到下调，同时减少了胶原蛋白的沉积；BECN1的mRNA水平未受到影响，但蛋白质水平在MSC-EV的处理下显著增加。因此，携带BECN1的MSC-EV可诱导BECN1/System xc-/GPX4介导铁死亡，并减少肝纤维化小鼠模型中HSC的活化。
4. BECN1通过下调System xC-/GPX4诱导LX-2铁死亡
在LX-2细胞中转染BECN1 cDNA后增加了BECN1的RNA和蛋白质水平，同时降低xCT和GPX4的表达水平，刺激细胞内ROS产生，降低了线粒体膜电位。同样，在LX-2细胞内敲低BECN1会增加xCT/GPX4表达，减少ROS产生，增加线粒体膜电位。表明BECN1可通过下调System xc-/GPX4的表达来诱导LX-2铁死亡。
铁自噬是一种选择性的自噬形式，可通过降解铁蛋白诱导铁死亡。WB结果显示，MSC-EV促进了LX-2细胞中LC3B的表达。基于BECN1是自噬起始因子，在细胞中过表达BECN1可以促进LC3BII的表达、增加Fe2+的水平。表明MSC-EV也可通过BECN1诱导铁自噬促进铁死亡。
5. 敲低BECN1减弱了MSC-EV对LX-2铁死亡的影响
分别分离敲低BECN1的MSC-EV和对照组EV，WB分析发现细胞内敲低BECN1后，其EV中BECN1水平相应降低，MSC-EV对LX-2细胞中GPX4和a-SMA的下调作用可被BECN1的敲低逆转，ROS水平的增加亦被BECN1的敲低逆转。在体内，BECN1的敲低减弱了MSC-EV对CCl4诱导的肝纤维化中胶原沉积的抑制作用，上调了GPX4和a-SMA的水平。
在MSC-EV处理的LX-2细胞中，检测到p-MLKL（坏死性凋亡执行蛋白）表达增加，但可被坏死性凋亡抑制剂NEC-1或NEC-1s逆转，同时MSC-EV诱导的LX-2细胞死亡和ROS产生作用可被NEC-1或NEC-1s减弱。表明MSC-EV可能诱导LX-2细胞坏死性凋亡。
总结：
在本研究中，作者证明了MSC-EV在体内外可靶向抑制HSC活化，通过携带BECN1下调HSC细胞内xCT/GPX4途径诱导铁死亡发生。这些成果可为理解MSC-EV对CCl4诱导的肝纤维化的保护作用提供不同的机制，HSC铁死亡可能是未来治疗肝纤维化的新方法。
铁死亡是由过度的脂质过氧化引起的调节性细胞死亡，在肝纤维化的发生发展中起着重要作用，BECN1是铁死亡的关键调节因子，但MSC-EV是否通过转运BECN1诱导HSC铁死亡尚未研究。江苏大学严永敏课题组探究了MSC-EV在HSC铁死亡中的作用及其作用机制，该研究于2022年4月发表在Cell Death & Disease(IF:9.685)上。 技术路线：
实验结果：
1. MSC-EV在体外诱导HSC铁死亡
基于铁死亡与慢性肝炎、肝纤维化和肝癌的发生发展密切相关，因此假设MSC-EV能通过调节HSC的铁死亡来改善纤维化。从MSC培养上清液分离EV后进行表征，再与LX-2细胞共孵育，FDA显示MSC-EV可诱导LX-2细胞死亡。分析铁死亡相关标志物发现，MSC-EV的作用下，细胞内ROS水平增加、线粒体膜电位降低、GSH降低、MDA和Fe2+增加，但铁死亡抑制剂NAC的存在可抑制MSC-EV的促铁死亡作用。同时通过TEM结果可以看出，在MSC-EV的作用下，LX-2细胞内线粒体皱缩，膜密度增加。
BECN1通过结合xCT阻断xc-活性来诱导铁死亡，接着研究BECN1是否参与MSC-EV的促铁死亡过程。利用WB检测发现BECN1在MSC-EV中富集，QPCR、IF和WB结果显示MSC-EV对BECN1的mRNA表达无影响，但会下调xCT和HSC活化标志物a-SMA的水平，上调BECN1的蛋白质水平。表明MSC-EV可能通过介导BECN1蛋白转移而不是BECN1 mRNA诱导HSC铁死亡。
为在体内探究MSC-EV诱导活化的HSC发生铁死亡，作者通过腹腔注射CCl4建立小鼠肝纤维化模型，再给予MSC-EV治疗，发现与对照组相比，MSC-EV处理的纤维化肝脏中xCT、GPX4和a-SMA的表达受到下调，同时减少了胶原蛋白的沉积；BECN1的mRNA水平未受到影响，但蛋白质水平在MSC-EV的处理下显著增加。因此，携带BECN1的MSC-EV可诱导BECN1/System xc-/GPX4介导铁死亡，并减少肝纤维化小鼠模型中HSC的活化。
在LX-2细胞中转染BECN1 cDNA后增加了BECN1的RNA和蛋白质水平，同时降低xCT和GPX4的表达水平，刺激细胞内ROS产生，降低了线粒体膜电位。同样，在LX-2细胞内敲低BECN1会增加xCT/GPX4表达，减少ROS产生，增加线粒体膜电位。表明BECN1可通过下调System xc-/GPX4的表达来诱导LX-2铁死亡。
分别分离敲低BECN1的MSC-EV和对照组EV，WB分析发现细胞内敲低BECN1后，其EV中BECN1水平相应降低，MSC-EV对LX-2细胞中GPX4和a-SMA的下调作用可被BECN1的敲低逆转，ROS水平的增加亦被BECN1的敲低逆转。在体内，BECN1的敲低减弱了MSC-EV对CCl4诱导的肝纤维化中胶原沉积的抑制作用，上调了GPX4和a-SMA的水平。
总结：
在本研究中，作者证明了MSC-EV在体内外可靶向抑制HSC活化，通过携带BECN1下调HSC细胞内xCT/GPX4途径诱导铁死亡发生。这些成果可为理解MSC-EV对CCl4诱导的肝纤维化的保护作用提供不同的机制，HSC铁死亡可能是未来治疗肝纤维化的新方法。